Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Summary

Muligheten av betent endotel å rekruttere leukocytter fra strømning reguleres av mesenchymale stromale celler. Vi beskriver to in vitro-modeller som har primære humane celler som kan brukes til å vurdere neutrofil rekruttering fra strømningen og undersøke rollen som mesenchymale stromale celler spiller i å regulere denne prosessen.

Abstract

Stromalceller regulere rekrutteringen av sirkulerende leukocytter under betennelse gjennom krysstale med nabo endotelceller. Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile granulocytter fra flyten av betente endotelceller. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere rollen til stromale celler, i dette tilfellet mesenchymale stamceller (MSC), i regulering av leukocytt-rekruttering.

Primære endotelceller ble dyrket alene eller sammen med human MSC i direkte kontakt på Ibidi microslides eller på motsatte sider av en Transwell filter i 24 timer. Kulturene ble stimulert med tumornekrosefaktor alfa (TNFa) i 4 timer og innlemmet i en strømningsbasert adhesjonsanalysen. En bolus av nøytrofile ble perfusertover endotelet i 4 min. Fangst av rennende nøytrofile og deres samspill med endotelet ble visualisert ved fasekontrastmikroskopi.

I begge modellene, økt cytokin-stimulering endothelial rekruttering av strømmer nøytrofile på en doseavhengig måte. Analyse av oppførselen til rekrutteres neutrofiler viste en doseavhengig reduksjon i rullende og en doseavhengig økning i transmigrasjon gjennom endotelet. I co-kultur, MSC trykt nøytrofiladhesjon til TNFa-stimulert endotelet.

Våre flytbasert-vedheft modeller ligne de innledende fasene av leukocytt rekruttering fra sirkulasjonen. I tillegg til leukocytter, kan de anvendes til å undersøke rekrutteringen av andre celletyper, slik som terapeutisk administrerte MSC eller sirkulerende tumorceller. Våre flerlags co-kultur modeller har vist at MSC kommunisere med endotelet til å endre sin respons på proinflammatoriske cytokiner, altering rekruttering av nøytrofile. Videre forskning ved hjelp av slike modeller er nødvendig for å fullt ut forstå hvordan stromale celler fra ulike vev og betingelsene (inflammatoriske lidelser eller kreft) påvirker rekruttering av leukocytter ved betennelse.

Introduction

Betennelse er en beskyttende respons på mikrobiell infeksjon eller vevsskade som krever tett regulering av leukocytt-inngang og utgang fra det betente vevet for å tillate oppløsning ^1,2. Krysstale mellom endotelceller (EC) at linjen blodkar, utegående leukocytter og vev-bosatt stromalceller er viktig for å koordinere denne prosessen ^tre. Men ukontrollert rekruttering av leukocytter og deres ineffektive klaring ligger til grunn for utvikling av kroniske betennelsessykdommer ^4. Vår nåværende forståelse av leukocytt rekruttering i helse og sykdom er ufullstendig og mer robuste modeller for å analysere denne prosessen.

Mekanismene som støtter rekruttering av leukocytter fra blod gjennom vaskulær EC i post-kapillære venuler har blitt godt beskrevet ^1,2,5. Sirkulerende leukocytter fanges opp av spesialiserte reseptorer (f.eks VCAM-1, E-selectin, P-selektinantistoffer) somer oppregulert på betent endotelet. Disse forbigående interaksjoner tillate leukocytter å samhandle med overflate bundet kjemokiner og lipid-avledet formidlere (enten endotelceller eller stromal opprinnelse) som aktiverer inte uttrykt av leukocytter ^{6- 11.} Dette i sin tur stabiliserer adhesjon og migrasjon stasjoner over endotelet og inn i vevet ^{12- 15.} Innenfor vev, leukocytter rekrutteres utsettes for stromal-avledet midler som påvirker deres motilitet, funksjon og overlevelse ^16,17. Økende bevis tyder på at signalene som mottas på hvert trinn i rekrutteringsprosessen vilkår leukocytter for den neste. Men vår forståelse av leukocytt rekruttering er fortsatt ufullstendig og svært lite er kjent om komponentene forme leukocytt bevegelse innenfor vev.

I Birmingham har vi utviklet flere in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av leukocytter fraflyte ^9,18,19. Nå forstår vi at vaskulær EC fungere som umiddelbare regulatorer av leukocytt rekruttering ta hensyn til endringer i deres lokale mikromiljøet. Nærmere bestemt, kan vev-resident stromalceller aktivt regulere betennelsesreaksjon, blant annet ved samtale med nabo vaskulær EC til å påvirke sin rolle i rekruttering ^tre. Vi har tidligere vist at forskjellige stromale celler modulerer evnen av EC å støtte adhesjon og migrasjon av leukocytter i en vev-spesifikk måte, og at disse virkninger blir endret i kroniske sykdommer ^13,16,20,21. Dermed stromalceller etablere vev 'adresse-koder' som definerer konteksten av hver betennelsesreaksjon ^22. Mer nylig, har vi vist at benmargs avledet MSC (BMMSC) potent nedregulerer responsen av EC til cytokiner, fører til en reduksjon i rekruttering av både neutrofiler og lymfocytter ^23.

Mekanismene governing rekruttering belyst in vitro har i stor grad brukes analyser innlemme et enkelt celletype (f.eks EF) eller protein i isolasjon. Men disse studier ikke ta hensyn til virkningene av lokale vev miljø (dvs. tilstedeværelse av stromale celler) på rekrutteringen av leukocytter og deres påfølgende migrasjon inn i vevet. Her beskriver vi to strømningsbaserte metoder hvor stromalceller, spesielt mesenchymale stamceller (MSC), er co-kultivert med EC ^23. Slike modeller tillate oss å undersøke effekten av stromal celle på endotelceller svar, spesielt deres evne til å støtte leukocytt rekruttering fra flyt.

Protocol

1. Isolering og Culture of Primary humane endotelceller og stamceller Isolasjon og kultur av menneskelige navleveneendotel celler (HUVEC): Sett navlestreng på et brett med tørkepapir og spray med 70% etanol. Plassere i en vev kultur hette. Identifisere venen og cannulate i begge ender. Plasser en strips rundt cannulated slutt å sikre det. Vask med venøst ​​blod med PBS ved anvendelse av en sprøyte. Fyll sprøyten med luft og passerer gjennom venen å ta bort den gjenværende PBS. <…

Representative Results

I utgangspunktet analysert vi effekten av stimulerende EC med TNFa på rekruttering av nøytrofile fra flyt bruker Ibidi microslide modell (§ 7 – 9). I fravær av TNFa, liten eller ingen neutrofiler klebet til endotel-monolag (figur 2A). Dette var ventet, som ubehandlet / hviler EF uttrykker ikke de nødvendige adhesjonsmolekyler (selectins) eller chemokiner å støtte bindende 25,26. I motsetning til dette cytokin-stimulering betydelig økt nøytrofil adhesjon til endotel p…

Discussion

Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile ved betent endotelet. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi har tidligere observert en doseavhengig økning i nøytrofil adhesjon til og transmigrasjon gjennom TNFa-stimulerte EC ^9,29. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere effektene av…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.