RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling
Summary
Genekspressionsanalyse af en delmængde af celler i et specifikt væv er en stor udfordring. I denne artikel beskrives, hvordan du isolere høj kvalitet total RNA fra en bestemt celle population ved at kombinere en hurtig immunolabeling metode med laser capture mikrodissektion.
Abstract
Laser capture mikrodissektion (LCM) muliggør isolering af specifikke celler fra tynde vævssnit med høj rumlig opløsning. Effektiv LCM kræver præcis identifikation af celler subpopulationer fra en heterogen væv. Identifikation af celler af interesse for LCM er normalt baseret på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein journalister. Kombinationen af LCM og hurtig immunolabeling tilbyder et alternativ og effektive midler til at visualisere bestemte celletyper og isolere dem fra omgivende væv. Høj kvalitet RNA kan derefter udvindes fra en ren cellepopulation og viderebehandles for downstream-applikationer, herunder RNA-sekventering, microarray eller QRT-PCR. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet udført, og kort beskrevet i nogle publikationer. Målet med denne artikel er at illustrere, hvordan du udfører hurtig immunolabeling af en celle population samtidig holde RNA integritet, og hvordan man isolere disse specifikke celler ved anvendelse LCM. Heri vi illustrered denne multi-trins procedure immunolabeling og opfange dopaminerge celler i hjernevæv fra en dag gamle mus. Vi fremhæve vigtige kritiske skridt, der fortjener særlig opmærksomhed. Denne protokol kan tilpasses til en række af væv og celler af interesse. Forskere fra forskellige områder vil sandsynligvis drage fordel af demonstration af denne fremgangsmåde.
Introduction
Hjernen består af en lang række forskellige neuron typer danner komplekse netværk. Disse neuroner er organiseret i forskellige grupper og undergrupper efter deres morfologi, tilslutningsmuligheder og genekspression mønster 1. Udviklingen af microarrays, næste generation sekventering, og QRT-PCR tilbydes mulighed for at sammenligne genekspression profiler af neuronale populationer i forskellige biologiske sammenhænge 1,2. Disse følsomme analyser kræver præcis identifikation og isolering af celletyper af interesse samtidig holde RNA integritet 2-4. Fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) teknik er i vid udstrækning blevet anvendt til at isolere specifikke celletyper baseret på celleoverflademarkører og / eller morfologi. FACS kræver en celle dissociation trin forud for sortering, hvilket resulterer i et fuldstændigt tab af rumlig opløsning 5. Mange neuronale subpopulationer skelnes fra hinanden efter deres anatomiske fordeling i the hjernen. Laser capture mikrodissektion anvendt på tynde hjernesnit giver en passende mulighed for specifik isolering af celler med høj rumlig opløsning 6-8. En væsentlig begrænsning af LCM har været behovet for at identificere celler af interesse baseret på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein reportere gensplejsede i dyremodeller. Udviklingen af nye teknikker til at udføre hurtige immunolabeling metoder, bevarede RNA integritet, kombineret med LCM, tillader nu isolering af cellesubpopulationer at gå videre med gen-profilering eksperimenter.
Denne fremgangsmåde er tidligere blevet udført, og kort beskrevet i nogle publikationer 1,9-13. Her viser vi en detaljeret procedure for at opnå høj kvalitet RNA fra en specifik undergruppe af celler i en kompleks vævsstruktur ved at kombinere hurtig immunmærkning med LCM. Vi viser, hvordan du udfører vigtige kritiske skridt til at opnå maksimal RNA genvinding og undgå RNA nedbrydning, da det kan SIGligt effekt genekspression profilering.
Til demonstration af denne protokol blev dopaminerge neuroner fra en dage gammel mus midthjernen målrettet. Dopaminerge neuroner kan immunolabeled anvendelse af et antistof rettet mod tyrosin hydroxylase (TH), det hastighedsbegrænsende enzym for dopamin-syntese. Efter TH immunfarvning, kan enkelte eller grupper af dopaminerge neuroner derefter isoleres ved hjælp af LCM. Mikrodissekterede celler opsamles i lysepuffer, og RNA ekstraheres ved hjælp af en RNA isolation kit. Kvaliteten og mængden af ekstraheret RNA måles ved hjælp af en Bioanalyzer 5. Yderligere analyse af genekspression ved anvendelse: RNA-sekventering, microarray, eller QRT-PCR kan efterfølgende udføres 2,4,6. Som et eksempel, er en to-trins QRT-PCR demonstreret på laser fanget isoleret dopaminerge domæner. Relativ kvantificering af ekspressionsniveauer af to dopaminerge neuron markørgener illustrerer selektivitet af denne protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiske punkt af denne metode består i mærkning celler af interesse samtidig forhindre RNA-nedbrydning. Da RNAser er aktive i vandige opløsninger, faldende inkubationstider forbedrer RNA bevaring 11,15. Alle reagenser, der skal behandles med DEPC at inaktivere RNAser. Alle materialer og overflader skal behandles med en overflade RNAse dekontaminering løsning for at forhindre RNAser kontaminering. Endelig, under disse betingelser, tilsætning af RNAse inhibitor i alle opløsninger er effektiv i a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
