Isolement de l'ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage
Summary
Gene analyse de l'expression d'un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l'ARN total de haute qualité à partir d'une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser.
Abstract
microdissection laser (LCM) permet l'isolement de cellules spécifiques de coupes de tissus minces à haute résolution spatiale. LCM efficace nécessite une identification précise des sous-populations de cellules d'un tissu hétérogène. Identification des cellules d'intérêt pour LCM est généralement basée sur des critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes. La combinaison de LCM et immunomarquage rapide offre un moyen alternatives et efficaces pour visualiser des types cellulaires spécifiques et de les isoler du tissu environnant. L'ARN de haute qualité peut alors être extraite d'une population cellulaire pur et un traitement supplémentaire pour des applications en aval, y compris l'ARN-séquençage, ou puce à ADN qRT-PCR. Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications. Le but de cet article est d'illustrer comment effectuer immunomarquage rapide d'une population de cellules tout en conservant l'intégrité de l'ARN, et comment isoler ces cellules spécifiques en utilisant LCM. Ici, nous illustronsd de cette procédure à étapes multiples et la capture par immunomarquage des cellules dopaminergiques dans le tissu cérébral de souris une jours d'âge. Nous soulignons étapes critiques clés qui méritent une attention particulière. Ce protocole peut être adapté à une variété de tissus et de cellules d'intérêt. Des chercheurs de différents domaines seront probablement bénéficier de la démonstration de cette approche.
Introduction
Le cerveau est composé d'une grande variété de différents types de neurones formant des réseaux complexes. Ces neurones sont organisés en groupes et sous-groupes distincts en fonction de leur morphologie, la connectivité et l'expression du gène modèle 1. Le développement de puces à ADN, séquençage de nouvelle génération, et qRT-PCR offrir la possibilité de comparer les profils d'expression génique de populations neuronales dans différents contextes biologiques 1,2. Ces analyses sensibles nécessitent l'identification précise et l'isolement de types de cellules d'intérêt tout en maintenant l'intégrité de l'ARN 2-4. Tri cellulaire (FACS) fluorescent activé technique a été largement utilisée pour isoler des types de cellules spécifiques sur la base de marqueurs et / ou morphologie de surface cellulaire. FACS nécessite une étape de dissociation de cellules avant le tri, qui se traduit par une perte complète de 5 résolution spatiale. De nombreux sous-populations neuronales se distinguent les unes des autres en fonction de leur distribution anatomique dans the cerveau. microdissection laser appliqué sur des coupes de cerveau minces fournit une option appropriée pour l'isolement spécifique de cellules à haute résolution spatiale 6-8. Une limite importante de LCM a été la nécessité d'identifier les cellules d'intérêt en fonction de critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes génétiquement modifiées dans des modèles animaux. Le développement de nouvelles techniques pour réaliser les méthodes d'immunomarquage rapides qui conservaient l'intégrité de l'ARN, en combinaison avec LCM, permet maintenant l'isolement des sous-populations de cellules pour procéder à des expériences de profilage de gène.
Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications 1,9-13. Ici, nous démontrons une procédure détaillée pour obtenir l'ARN de haute qualité à partir d'un sous-ensemble spécifique de cellules dans une structure de tissus complexes en combinant immunomarquage rapide avec LCM. Nous montrons comment effectuer les étapes clés essentielles pour obtenir la récupération de l'ARN maximale et d'éviter la dégradation de l'ARN comme il peut sigsignificative gène d'impact profilage d'expression.
Pour la démonstration de ce protocole, les neurones dopaminergiques du mésencéphale de la souris d'un jour vieux ont été ciblés. Les neurones dopaminergiques peuvent être immunomarquées utilisant un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH), l'enzyme limitant la vitesse pour la synthèse de la dopamine. Suite à une immunocoloration TH, des groupes de neurones dopaminergiques individuel ou peut ensuite être isolé en utilisant LCM. Microdisséquées cellules sont recueillies dans le tampon de lyse, et l'ARN est extrait en utilisant un kit d'isolement d'ARN. Qualité et quantité de l'ARN extrait sont mesurées en utilisant un bioanalyseur 5. Une analyse plus poussée de l'expression génique en utilisant le séquençage d'ARN, puce à ADN, ou qRT-PCR peut ensuite être effectuée 2,4,6. A titre d'exemple, en deux étapes une qRT-PCR est mise en évidence sur les domaines capturé laser dopaminergiques isolé. Quantification relative des niveaux de gènes marqueurs de deux neurones dopaminergiques d'expression illustre la sélectivité de ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le point le plus critique de cette méthode consiste à étiqueter les cellules d'intérêt, tout en empêchant la dégradation des ARN. Comme RNAses sont actives dans des solutions aqueuses, ce qui diminue les temps d'incubation permet d'améliorer la conservation de l'ARN 11,15. Toutes les solutions utilisées doivent être traités avec DEPC pour inactiver RNAses. Tous les matériaux et les surfaces doivent être traités avec une solution de décontamination de surface d'ARNase pour em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
