迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離
Summary
特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。
Abstract
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、高空間分解能を有する薄い組織切片から特定の細胞の単離を可能にする。効果的なLCMは、異種の組織からの細胞の亜集団の正確な同定を必要とします。 LCMのための目的の細胞の同定は、通常、形態学的基準や蛍光タンパク質レポーターに基づいています。 LCMおよび迅速な免疫標識の組み合わせは、特定の細胞型を視覚化し、周囲の組織から隔離するための代替的かつ効率的な手段を提供する。高品質RNAは、その後、純粋な細胞集団から抽出し、さらにRNA配列決定、マイクロアレイまたは定量RT-PCRなどの下流の適用のために処理することができる。このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物に記載されている。この記事の目的は、RNAの完全性を維持しながら、細胞集団の迅速な免疫標識を実行する方法を説明するために、どのようにLCMを用いて、これらの特定の細胞を単離することである。ここで、我々は説明するdは、この多段階手順1日齢マウスからの脳組織におけるドーパミン作動性細胞の免疫標識および捕捉することができる。我々は、特別な配慮に値する重要な重要なステップを強調表示します。このプロトコルは、目的の組織および種々の細胞に適合させることができる。異分野の研究者らは、おそらくこのアプローチのデモの恩恵を受ける。
Introduction
脳は、複雑なネットワークを形成する異なるニューロンタイプの多種多様で構成されている。これらのニューロンは、それらの形態、接続性と遺伝子発現パターン1に係る個別のグループおよびサブグループに編成されています。マイクロアレイ、次世代シーケンシング、および定量RT-PCRの開発は、異なる生物学的状況1,2におけるニューロン集団の遺伝子発現プロファイルを比較するための可能性を提供する。 RNAの完全性を維持しながら、2-4これらの高感度分析は、目的の細胞型の正確な同定および単離を必要とする。蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術が広く細胞表面マーカーおよび/または形態学に基づいて、特定の細胞型を単離するために使用されている。 FACSは、空間分解能5の完全な損失をもたらすソーティング前の細胞解離段階を必要とします。多くのニューロンの亜集団は、目での解剖学的分布に応じて互いに区別さEの脳。薄い脳切片に適用レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、高空間分解能6-8での細胞の特定の分離のための適切なオプションを提供します。 LCMの主な制限は、形態学的基準または遺伝的動物モデルで操作蛍光タンパク質レポーターに基づいて目的の細胞を同定するために必要であった。 LCMと組み合わせて、RNAの完全性を保存クイック免疫標識法を行うための新しい技術の開発が、現在、遺伝子プロファイリング実験を続行する細胞亜集団の単離を可能にする。
このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物1,9-13に記載されている。ここでは、LCMを迅速免疫標識を組み合わせることによって、複雑な組織構造内の細胞の特定のサブセットから高品質のRNAを得るための詳細な手順を示す。我々は、最大のRNA回収率を得るために重要な重要なステップを実行し、sigができるように、RNAの分解を回避する方法を示してnificantly遺伝子発現プロファイリングに影響を与える。
このプロトコルのデモンストレーションのために、1日齢のマウスの脳からドーパミン作動性ニューロンが標的とされた。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン合成の律速酵素に対する抗体を用いて免疫標識することができる。 TH免疫染色に続いて、ドーパミン作動性ニューロンの個人またはグループは、その後LCMを用いて単離することができる。顕微解剖した細胞を、溶解緩衝液中に収集され、そしてRNAは、RNA単離キットを用いて抽出した。品質と抽出されたRNAの量は、バイオアナライザー5を使用して測定される。用いた遺伝子発現のさらなる分析：RNA配列決定、マイクロアレイ、または定量RT-PCRは、続いて2,4,6-を行うことができる。一例として、二段階のqRT-PCRは、単離されたドーパミン作動性ドメインを捕捉し、レーザーで実証されている。 2ドーパミン作動性ニューロンのマーカー遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、このプロトコルの選択性を示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法の最も重要な点は、RNAの分解を防止しながら、目的の細胞を標識することにある。 RNA分解酵素は、水溶液中でアクティブであるため、インキュベーション時間を減少させることは、RNAの保全11,15を向上させます。使用されるすべてのソリューションは、RNアーゼを不活性化するDEPCで処理しなければならない。全ての材料及び表面がRNアーゼ汚染を防ぐための表面のRNAse汚染除?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
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