RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura
Summary
Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.
Abstract
Microdissezione laser (LCM) permette l'isolamento di cellule specifiche da sezioni di tessuto sottili con alta risoluzione spaziale. LCM efficace richiede una precisa identificazione di cellule sottopopolazioni da un tessuto eterogeneo. Identificazione di cellule di interesse per LCM è di solito basato su criteri morfologici o reporter proteina fluorescente. La combinazione di LCM e rapido immunomarcatura offre un mezzo alternativo ed efficace di visualizzare specifici tipi cellulari e di isolarli dal tessuto circostante. RNA di alta qualità può essere estratto da una popolazione di cellule puro e ulteriormente trattati per applicazioni a valle, tra cui RNA-sequencing, microarray o qRT-PCR. Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritto in alcune pubblicazioni. L'obiettivo di questo articolo è quello di illustrare come eseguire una rapida immunomarcatura di una popolazione di cellule, mantenendo l'integrità dell'RNA, e come isolare queste cellule specifici utilizzando LCM. Qui, illustriamod questa procedura multi-passo immunomarcatura e catturando cellule dopaminergiche nel tessuto cerebrale da un giorno d'età topi. Evidenziamo chiave passaggi critici che meritano particolare attenzione. Questo protocollo può essere adattato ad una varietà di tessuti e cellule di interesse. I ricercatori di diversi settori probabilmente beneficiare della dimostrazione di questo approccio.
Introduction
Il cervello è composto da una grande varietà di diversi tipi di neuroni che formano reti complesse. Questi neuroni sono organizzati in gruppi distinti e sottogruppi in base alla loro morfologia, la connettività e l'espressione genica modello 1. Lo sviluppo di microarrays, sequenziamento di prossima generazione, e qRT-PCR offerta la possibilità di confrontare i profili di espressione genica di popolazioni neuronali in differenti contesti biologici 1,2. Queste analisi sensibili richiedono l'identificazione precisa e l'isolamento di tipi cellulari di interesse, mantenendo l'integrità RNA 2-4. Fluorescente cell sorting (FACS) tecnica attivato è stato ampiamente utilizzato per isolare specifici tipi cellulari basati su marcatori di superficie cellulare e / o morfologia. FACS richiede una fase di dissociazione cellulare prima di smistamento, che si traduce in una perdita completa della risoluzione spaziale 5. Molti sottopopolazioni neuronali si distinguono gli uni dagli altri in base alla loro distribuzione anatomica in the cervello. Microdissezione laser applicata su sezioni di cervello sottili fornisce un'opzione adeguata per specifico isolamento di cellule con alta risoluzione spaziale 6-8. Una limitazione importante di LCM è stata la necessità di individuare le cellule di interesse sulla base di criteri morfologici o reporter di proteine fluorescenti geneticamente in modelli animali. Lo sviluppo di nuove tecniche per eseguire metodi immunomarcatura veloci che conservano l'integrità dell'RNA, in combinazione con LCM, consente ora l'isolamento delle sottopopolazioni di cellule di procedere con esperimenti-genica.
Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritti in poche pubblicazioni 1,9-13. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata per ottenere RNA di alta qualità da uno specifico sottogruppo di cellule in una struttura del tessuto complessa combinando immunomarcatura rapido con LCM. Mostriamo come eseguire principali passaggi critici per ottenere il recupero RNA massima e di evitare la degradazione dell'RNA come può sigsignificativamente gene impatto profilo di espressione.
Per la dimostrazione di questo protocollo, i neuroni dopaminergici da un giorno-vecchio mouse mesencefalo stati presi di mira. Neuroni dopaminergici possono essere immunolabeled utilizzando un anticorpo diretto contro la tirosina idrossilasi (TH), l'enzima limitante per la sintesi della dopamina. Dopo immunostaining TH, individuali o gruppi di neuroni dopaminergici possono quindi essere isolato con LCM. Microdissezione cellule sono raccolte in tampone di lisi, e RNA viene estratto utilizzando un kit di isolamento di RNA. Qualità e quantità di RNA estratto sono misurati utilizzando un Bioanalyzer 5. Ulteriori analisi dell'espressione genica utilizzando: RNA sequencing, microarray, o qRT-PCR può essere successivamente eseguita 2,4,6. Come esempio, in due fasi qRT-PCR è dimostrata sulle laser catturato domini isolati dopaminergici. Quantificazione relativa dei livelli di espressione di due geni marcatori dopaminergici neuron illustra la selettività di questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il punto più critico di questo metodo consiste nel etichettatura cellule di interesse impedendo la degradazione dell'RNA. Come RNasi sono attivi in soluzione acquosa, diminuendo i tempi di incubazione migliora conservazione RNA 11,15. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere trattati con DEPC per inattivare RNasi. Tutti i materiali e le superfici devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione RNAse superficie per evitare la contaminazione RNasi. Infine, in queste condizioni, l'aggiun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
