Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma
Summary
Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.
Abstract
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yüksek uzaysal çözünürlüğü ile ince doku bölümleri belirli hücrelerin izolasyonu sağlar. Etkili LCM heterojen doku hücreleri alt popülasyonlar hassas tanımlanmasını gerektirir. LCM ilgi hücrelerin tanımlanması, genellikle morfolojik kriterlere veya flöresanlı proteinin, muhabir dayanmaktadır. LCM ve hızlı immunolabeling kombinasyonu alternatif ve etkili bir araç özel hücre tiplerini görselleştirmek ve çevresindeki doku onları izole etmek için sunuyor. Kaliteli RNA daha sonra saf hücre popülasyonu elde edilmesi ve daha RNA dizileme, mikrotertibin veya Mah-PCR olmak üzere mansap uygulamalar için işlenmiş olabilir. Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az yayınlarda tarif edilmiştir. Bu makalenin amacı nasıl LCM kullanarak bu özel hücrelerin izole RNA bütünlüğünü tutarak, ve sırasında hücre popülasyonu hızla immün gerçekleştirmek için nasıl göstermek için. Burada, biz göstermekd immün ve bir günlük farelerden elde edilen beyin dokusu dopaminerjik hücrelerin yakalamak için bu çok aşamalı bir prosedür. Biz özel dikkat hak anahtar kritik adımlar vurgulayın. Bu protokol, doku ve ilgi çeşitli hücreler için adapte edilebilir. Farklı alanlardan gelen araştırmacılar büyük olasılıkla bu yaklaşımın gösterilmesi yararlanacaktır.
Introduction
Beyin, karmaşık ağlar oluşturan farklı nöron tiplerinin çok çeşitli oluşmaktadır. Bu nöronlar kendi morfolojisi, bağlantı ve gen ifadesi desen 1'e göre farklı gruplar ve alt organize edilmektedir. mikrodizileri gelişimi, yeni nesil dizileme ve Mah-PCR, farklı biyolojik bağlamlarda 1,2 nöronal nüfus gen ekspresyon profillerini karşılaştırma olanağı sundu. Bu hassas analizler RNA bütünlüğü 2-4 tutarken ilgi hücre tiplerinin kesin belirlenmesi ve izolasyon gerektirir. Floresan etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) tekniği çok hücre yüzeyi işaretleri ve / veya morfolojiye göre özel hücre tiplerini izole etmek için kullanılmıştır. FACS uzamsal çözünürlük 5 tam bir kayıp ile sonuçlanır önce sıralama, bir hücre ayırma aşamasını gerektirir. Bir çok alt-popülasyonları bulunduğunu nöronal th anatomik dağılıma göre birbirlerinden ayırt edilirlerE beyin. İnce beyin bölümlerinde uygulanan lazer yakalama mikrodiseksiyon yüksek uzaysal çözünürlüğü 6-8 ile hücrelerin spesifik izolasyonu için uygun bir seçenek sunar. LCM önemli bir sınırlama, morfolojik kriterlere ya da genetik olarak hayvan modellerinde tasarlanmış floresan protein muhabir göre ilgi hücreleri belirlemek için bir ihtiyaç olmuştur. LCM ile kombinasyon halinde, bir RNA bütünlüğü korunur pratik immün yöntemleri gerçekleştirmek için yeni tekniklerin geliştirilmesi, hemen gen profil deney devam etmek için hücre alt izolasyonunu sağlar.
Bu yaklaşım, daha önce gerçekleştirilen ve kısa bir süre az sayıda yayın 1,9-13 tarif edilmiştir. Burada, biz LCM ile hızlı immün birleştirerek karmaşık bir doku yapısında belirli bir hücre alt kümesi yüksek kaliteli RNA elde etmek için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz maksimum RNA kurtarma elde etmek için anahtar kritik adımları uygulayın ve sig olabilir RNA bozulmasını önlemek için nasıl göstermekanlamlı ölçüde etki gen ekspresyon profili.
Bu protokolün gösteri için, bir günlük fare orta beyin dopaminerjik nöronlar hedef alındı. Dopaminerjik nöronlar, tirosin hidroksilaz (TH) karşı yönlendirilmiş bir antikor, dopamin sentezi için oran-sınırlayıcı enzim kullanılarak imüno edilebilir. TH immun boyama sonra, tek tek ya da dopaminerjik nöronların grupları daha sonra LCM kullanılarak izole edilebilir. Microdissected hücreler lizis tamponu içinde toplanır ve RNA, RNA izolasyon kiti kullanılarak ekstre edilir. Kalite ve çıkarılan RNA miktarı Bioanalyzer 5 kullanılarak ölçülmektedir. Kullanılarak gen tanımının diğer analizleri: RNA sıralanması, mikrodizi veya qRT-PCR, daha sonra 2,4,6 gerçekleştirilebilir. Bir örnek olarak, bir iki-aşamalı QRT-PCR lazer yakalanan izole dopaminerjik etki ile gösterilmiştir. Iki dopaminerjik nöron marker genlerinin ekspresyon seviyeleri rölatif ölçümü, bu protokol seçicilik göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin en kritik nokta RNA bozulmasını önlerken ilgi hücreleri etiketleme oluşur. RNases sulu çözeltilerde aktif olarak kuluçka süreleri azalan RNA koruma 11,15 geliştirir. Kullanılan tüm çözümler RNases inaktive DEPC ile tedavi edilmelidir. Tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz'larına kirlenmeyi önlemek için bir yüzey RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilmesi gerekir. Son olarak, bu koşullar altında, her Çözeltilerin RNaz inhibitörü ilave bozunmadan RNA koruma etkili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
