Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling
Summary
La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.
Abstract
Microdisección de captura por láser (LCM) permite el aislamiento de células específicas a partir de secciones de tejido delgadas con alta resolución espacial. LCM eficaz requiere la identificación precisa de las células subpoblaciones de un tejido heterogéneo. Identificación de células de interés para LCM generalmente se basa en criterios morfológicos o en los periodistas de proteínas fluorescentes. La combinación de LCM y immunolabeling rápida ofrece un medio alternativo y eficientes para visualizar determinados tipos de células y de aislarlos de los tejidos circundantes. ARN de alta calidad puede entonces ser extraído a partir de una población celular puro y se procesa adicionalmente para aplicaciones posteriores, incluyendo ARN de secuenciación, microarrays o QRT-PCR. Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en algunas publicaciones. El objetivo de este artículo es ilustrar cómo realizar una rápida immunolabeling de una población celular mientras se mantiene la integridad del ARN, y la forma de aislar estas células específicas mediante LCM. En esto, ilustramosd este procedimiento multi-paso por inmunomarcaje y la captura de células dopaminérgicas en el tejido cerebral de los ratones de un día de edad. Destacamos pasos críticos clave que merecen una consideración especial. Este protocolo se puede adaptar a una variedad de tejidos y células de interés. Investigadores de diferentes ámbitos probablemente se beneficiarán de la manifestación de este enfoque.
Introduction
El cerebro se compone de una gran variedad de diferentes tipos de neuronas que forman redes complejas. Estas neuronas se organizan en grupos distintos y subgrupos en función de su morfología, la conectividad y la expresión génica patrón 1. El desarrollo de microarrays, secuenciación de próxima generación, y QRT-PCR ofrecen la posibilidad de comparar los perfiles de expresión genética de poblaciones neuronales en diferentes contextos biológicos 1,2. Estos análisis sensibles requieren la identificación precisa y el aislamiento de los tipos de células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN 2-4. Técnica fluorescente de células activadas (FACS) ha sido ampliamente usado para aislar determinados tipos de células basados en marcadores y / o la morfología de la superficie celular. FACS requiere una etapa de disociación de células antes de la clasificación, lo que resulta en una pérdida completa de la resolución espacial 5. Muchos subpoblaciones neuronales se distinguen una de otra de acuerdo con su distribución anatómica en ºe cerebro. Microdisección de captura por láser aplicado en las secciones del cerebro delgadas proporciona una opción apropiada para el aislamiento específico de células con alta resolución espacial 6.8. Una limitación importante de LCM ha sido la necesidad de identificar las células de interés sobre la base de criterios morfológicos o en reporteros de proteínas fluorescentes de ingeniería genética en modelos animales. El desarrollo de nuevas técnicas para llevar a cabo los métodos de immunolabeling rápidas que conservan la integridad del ARN, en combinación con LCM, ahora permite el aislamiento de las subpoblaciones de células para proceder con los experimentos de genes de perfiles.
Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en pocas publicaciones 1,9-13. Aquí, nos demuestran un procedimiento detallado para obtener ARN de alta calidad a partir de un subconjunto específico de células en una estructura de tejido complejo combinando immunolabeling rápido con LCM. Mostramos cómo realizar los pasos críticos claves para obtener la recuperación de ARN máxima y evitar la degradación del ARN, ya que puede sigsignificativamente el perfil de expresión génica de impacto.
Para la demostración de este protocolo, fueron blanco de las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio de un día de edad de ratón. Las neuronas dopaminérgicas pueden ser immunolabeled usando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (TH), la enzima limitante de la velocidad para la síntesis de la dopamina. Siguiendo inmunotinción TH, individuo o grupos de neuronas dopaminérgicas entonces se puede aislar usando LCM. Microdissected células se recogen en el tampón de lisis, y se extrae el ARN usando un kit de aislamiento de ARN. Calidad y cantidad de ARN extraído se miden usando un bioanalizador 5. Un análisis más detallado de la expresión génica usando: secuenciación de RNA, microarrays, o QRT-PCR posteriormente se puede realizar 2,4,6. Como ejemplo, una de dos pasos QRT-PCR se demuestra en los dominios aislados dopaminérgicas láser capturado. Cuantificación relativa de los niveles de expresión de dos genes marcadores dopaminérgicos neurona ilustra la selectividad de este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El punto más crítico de este método consiste en etiquetar células de interés, mientras que la prevención de la degradación del ARN. Como ARNasas son activos en soluciones acuosas, la disminución de los tiempos de incubación mejora la conservación de ARN 11,15. Todas las soluciones utilizadas deben ser tratados con DEPC para inactivar RNAsas. Todos los materiales y superficies deben ser tratados con una solución de descontaminación ARNasa superficie para evitar la contaminación ARNasas. Finalmente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
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