सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग
Summary
एक विशिष्ट ऊतकों में कोशिकाओं के एक सबसेट के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। यह लेख लेजर कब्जा microdissection के साथ एक तेजी से immunolabeling विधि संयोजन के द्वारा एक विशेष सेल आबादी से उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना को अलग करने के लिए कैसे करें।
Abstract
लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम) उच्च स्थानिक संकल्प के साथ पतली ऊतक वर्गों से विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। प्रभावी एलसीएम एक विषम ऊतक कोशिकाओं से उप-जनसंख्या की सटीक पहचान की आवश्यकता है। एलसीएम के लिए ब्याज की कोशिकाओं की पहचान आमतौर पर रूपात्मक मापदंड पर या फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं पर आधारित है। एलसीएम और तेजी से immunolabeling के संयोजन के लिए एक विकल्प और कारगर साधन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए और आसपास के ऊतकों से उन्हें अलग करने के लिए प्रदान करता है। उच्च गुणवत्ता आरएनए तो एक शुद्ध सेल की आबादी से निकाला जा सकता है और आगे शाही सेना अनुक्रमण, माइक्रोएरे या qRT- पीसीआर सहित बहाव के अनुप्रयोगों, के लिए कार्रवाई कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण पहले से प्रदर्शन किया और संक्षेप में कुछ प्रकाशनों में वर्णित किया गया है। इस लेख का लक्ष्य कैसे एलसीएम का उपयोग कर इन विशिष्ट कोशिकाओं को अलग करने के लिए शाही सेना अखंडता रखते हुए, और जबकि एक सेल की आबादी का तेजी से immunolabeling प्रदर्शन करने के लिए कैसे वर्णन करने के लिए है। इस के साथ साथ, हम को वर्णनडी immunolabeling और एक दिन पुरानी चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में डोपामिनर्जिक कोशिकाओं पर कब्जा करके इस बहु कदम प्रक्रिया। हम विशेष विचार के लायक है कि कुंजी महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों और ब्याज की कोशिकाओं की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विभिन्न क्षेत्रों से शोधकर्ताओं की संभावना इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन करने से लाभ होगा।
Introduction
मस्तिष्क जटिल नेटवर्क के गठन के विभिन्न न्यूरॉन प्रकार की एक विशाल विविधता से बना है। इन न्यूरॉन्स उनकी आकृति विज्ञान, कनेक्टिविटी और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न एक के अनुसार अलग समूहों और उपसमूहों में आयोजित कर रहे हैं। प्रोटीन का विकास, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और QRT- पीसीआर विभिन्न जैविक संदर्भों 1,2 में neuronal आबादी के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल तुलना करने के लिए संभावना की पेशकश की। इन संवेदनशील विश्लेषण आरएनए अखंडता 2-4 रखते हुए ब्याज की सेल प्रकार की सटीक पहचान और अलगाव की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) तकनीक का व्यापक रूप से सेल सतह मार्करों और / या आकृति विज्ञान के आधार पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। FACS के स्थानिक संकल्प 5 का एक पूरा नुकसान में जो परिणाम से पहले छँटाई करने के लिए एक सेल हदबंदी कदम की आवश्यकता है। कई न्यूरोनल उप-जनसंख्या वीं में उनके शारीरिक वितरण के अनुसार एक दूसरे से प्रतिष्ठित हैंई मस्तिष्क। पतली मस्तिष्क वर्गों पर लागू लेजर कब्जा microdissection के उच्च स्थानिक संकल्प 6-8 के साथ कोशिकाओं के विशिष्ट अलगाव के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है। एलसीएम का एक प्रमुख सीमा रूपात्मक मापदंड पर या आनुवंशिक रूप से पशु मॉडल में इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने की आवश्यकता पर किया गया है। एलसीएम के साथ संयोजन में, आरएनए अखंडता संरक्षित है कि जल्दी immunolabeling तरीकों का प्रदर्शन करने के लिए नई तकनीकों के विकास, अब जीन की रूपरेखा प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने के लिए सेल उप-जनसंख्या के अलगाव की अनुमति देता है।
यह दृष्टिकोण पहले से प्रदर्शन किया और संक्षेप में कुछ प्रकाशनों 1,9-13 में वर्णित किया गया है। यहाँ, हम एलसीएम साथ त्वरित immunolabeling संयोजन के द्वारा एक जटिल ऊतक संरचना में कोशिकाओं का एक विशिष्ट सबसेट से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है। हम अधिक से अधिक शाही सेना वसूली प्राप्त करने के लिए कुंजी महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शन और यह हस्ताक्षर हो सकता है के रूप में शाही सेना गिरावट से बचने के लिए कैसे दिखाएँnificantly प्रभाव जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा।
इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के लिए, एक दिन पुरानी माउस मध्यमस्तिष्क से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स निशाना बनाया गया। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase (ध) के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी, डोपामाइन संश्लेषण के लिए दर सीमित एंजाइम का उपयोग कर immunolabeled जा सकता है। वें immunostaining के बाद, व्यक्ति या डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के समूहों तो एलसीएम का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। Microdissected कोशिकाओं lysis बफर में एकत्र कर रहे हैं, और शाही सेना एक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर निकाला जाता है। गुणवत्ता और निकाले शाही सेना की मात्रा एक Bioanalyzer 5 का उपयोग कर मापा जाता है। का उपयोग करते हुए जीन अभिव्यक्ति के आगे विश्लेषण: शाही सेना अनुक्रमण, माइक्रोएरे, या qRT- पीसीआर बाद में 2,4,6 प्रदर्शन किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, एक दो कदम QRT- पीसीआर लेजर कब्जा कर लिया पृथक डोपामिनर्जिक डोमेन पर प्रदर्शन किया है। दो डोपामिनर्जिक न्यूरॉन मार्कर जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के सापेक्ष मात्रा का ठहराव इस प्रोटोकॉल के चयनात्मकता दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि के सबसे महत्वपूर्ण बिंदु आरएनए गिरावट को रोकने, जबकि ब्याज की कोशिकाओं लेबलिंग में होते हैं। RNases जलीय समाधान में सक्रिय हैं, ऊष्मायन बार घटते शाही सेना संरक्षण 11,15 में सुधार। उपयोग किए गए सभी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
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