RNA Isolering från Cell Specifika Subpopulationer Använda Laser-capture Microdissection Kombinerat med Rapid immunomärkning

Summary

Genuttryck analys av en delmängd av celler i en specifik vävnad utgör en stor utmaning. I artikeln beskrivs hur du isolera högkvalitativa total-RNA från en specifik cellpopulation genom att kombinera en snabb immunomärkning metod med laser capture microdissection.

Abstract

Laser capture microdissection (LCM) möjliggör isolering av specifika celler från tunna sektioner vävnad med hög rumslig upplösning. Effektiv LCM kräver exakt identifiering av celler subpopulationer från en heterogen vävnad. Identifiering av celler av intresse för LCM är vanligtvis baserad på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar. Kombinationen av LCM och snabb immunomärkning erbjuder ett alternativt och effektivt sätt att visualisera specifika celltyper och att isolera dem från omgivande vävnad. Högkvalitativ RNA kan sedan extraheras från en ren cellpopulation och bearbetas vidare för tillämpningar efter, inklusive RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Detta synsätt har tidigare utförts och kortfattat beskrivet i några publikationer. Målet med denna artikel är att belysa hur man utför en snabb immunomärkning av en cellpopulation samtidigt RNA integritet, och hur man kan isolera dessa specifika celler med hjälp LCM. Häri vi illustrerad detta förfarande i flera steg genom immunomärkning och fånga dopaminerga celler i hjärnvävnad från en dag gamla möss. Vi belysa viktiga kritiska steg som förtjänar särskild uppmärksamhet. Detta protokoll kan anpassas till en variation av vävnader och celler av intresse. Forskare från olika områden kommer sannolikt gynnas av demonstration av denna strategi.

Introduction

Hjärnan består av ett stort utbud av olika neuron typer bildar komplexa nätverk. Dessa nervceller är organiserade i olika grupper och undergrupper enligt deras morfologi, uppkoppling och genuttryck mönster ^1. Utvecklingen av mikroarrayer, nästa generations sekvensering, och QRT-PCR erbjöd möjligheten att jämföra genuttrycksprofilerna av neuronala populationer i olika biologiska sammanhang ^1,2. Dessa känsliga analyser kräver exakt identifiering och isolering av celltyper av intresse samtidigt hålla RNA integritet ^2-4. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik har använts i stor omfattning för att isolera specifika celltyper baserade på markörer och / eller morfologi på cellytan. FACS kräver en cell dissociation steg före sortering, vilket resulterar i en fullständig förlust av rumslig upplösning ^5. Många neuronala subpopulationer särskiljs från varandra enligt deras anatomiska distribution i the hjärnan. Laser capture microdissection appliceras på tunna hjärnsektioner ger ett lämpligt alternativ för specifik isolering av celler med hög rumslig upplösning ^6-8. En viktig begränsning av LCM har varit behovet att identifiera celler av intresse baserade på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar genmanipulerade i djurmodeller. Utvecklingen av nya tekniker för att utföra snabba immunomärkning metoder som bevarade RNA integritet, i kombination med LCM, gör det nu möjligt isolering av cellpopulationer att gå vidare med gen-profileringsexperiment.

Detta synsätt har tidigare utförts och beskrivs kortfattat i några publikationer ^1,9-13. Här visar vi ett detaljerat förfarande för att få hög kvalitet RNA från en särskild undergrupp av celler i en komplex vävnadsstruktur genom att kombinera snabb immunomärkning med LCM. Vi visar hur du utför viktiga kritiska åtgärder för att få maximal RNA återhämtning och undvika RNA nedbrytning eftersom det kan SIGligt slag genuttryck profilering.

För demonstration av detta protokoll, var dopaminerga neuroner från en-dag-gamla mus mitthjärnan riktade. Dopaminerga neuroner kan immunolabeled användning av en antikropp riktad mot tyrosinhydroxylas (TH), det hastighetsbegränsande enzymet för dopaminsyntes. Efter TH immunfärgning, enskilda eller grupper av dopaminerga nervceller kan sedan isoleras med hjälp av LCM. Microdissected Cellerna uppsamlas i lysbuffert, och RNA extraheras med användning av ett RNA-isoleringskit. Kvalitet och kvantitet av extraherat RNA mäts med hjälp av en bioanalyzer ^5. Ytterligare analys av genuttryck använder: RNA-sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan därefter utföras ^2,4,6. Som ett exempel, är en två-stegs QRT-PCR demonstrerade på laser fångade isolerade dopaminerga domäner. Relativ kvantifiering av expressionsnivåer av två dopaminerga neuron markörgener illustrerar selektivitet detta protokoll.

Protocol

OBS: Experimenten utfördes i enlighet med den kanadensiska Guide för skötsel och användning av försöksdjur och godkändes av Université Laval djurskyddskommitté. 1. Provframställning OBS: I det här exemplet har vi använt mushjärnor på postnatal dag 1. Använd hypotermi anestesi i krossad is i 3 till 4 min för valpar, sedan dissekera hjärnor så fort som möjligt i iskallt L15 medium. Utför detta steg inom 2 min. Överför diss…

Representative Results

Detta snabbförfarande immunomärkning möjliggör visualisering av celler av intresse och samtidigt hålla RNA integritet. Figur 1 visar stegen förberedelser vävnad innan RNA-extraktion. Efter cryosectioning är dopaminerga neuroner märkta med användning av en antikropp riktad mot tyrosinhydroxylas (märkta neuroner visas i brunt). Beroende av den experimentella frågan, kan enstaka celler eller större område av intresse isoleras med hjälp av LCM (Figur 1D – E)….

Discussion

Den mest kritiska punkten av denna metod består i att märka celler av intresse samtidigt förhindra RNA nedbrytning. Som RNAs är aktiva i vattenlösningar, minskar inkubationstider förbättrar RNA bevarande ^11,15. Alla lösningar som används måste behandlas med DEPC att inaktivera RNAs. Alla material och ytor måste behandlas med en yta RNAs dekontamineringslösning att förhindra RNAs kontamination. Slutligen, under dessa förhållanden, är tillsatsen av RNAs-inhibitor i alla lösningar effektiva i at…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR