Человек Дюпюитрена<em> Ex Vivo</em> Культура по изучению Миофибробласты и внеклеточный матрикс взаимодействий
Summary
Болезнь Дюпюитрена (ДД) является фибропролиферативных заболевание ладони. Здесь мы приводим протокол к культуре резекции образцов из DD в трехмерном (3D) системе культуры. Такая краткосрочная система культуры позволяет сохранение структуры 3D и молекулярные свойства фиброзной ткани.
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Болезнь Дюпюитрена (DD), доброкачественная фибропролиферативных заболевание вызывает постоянное сгибание пальцев в связи с образованием узелков и шнуры в ладони. Хотя болезнь распространилась особенно высока среди кавказцев Северной Европы, основной генетический этиология этого заболевания остается неизвестной 1. Основной характеристикой ДД избыточное производство внеклеточного матрикса (ECM) белков (например, коллагена), которые образуют жесткую волокнистую ткань, занимающий пространство между жилами и кожи ладони и пальцев, постоянно нарушая тонких движений от руки 2, 3. рецидив болезни, говорит о внутренней генетические изменения в качестве причины фиброза 1, 4. эффективное лечение может быть ориентирована непосредственно на неконтролируемые фиброзные механизмы на клеточном и молекулярном уровне.
Наша последняя работа на фиброз привело нас к развитиюНовая система культуры 3D, что позволяет краткосрочный культуру человека фиброзной ткани с потенциалом тестирования на наркотики. Эта система помогла преодолеть предельный подход 2D фибробластов культур и определить роль частичного вниз регулирования, достигнутый пропуска экзона, в пути активации TGF-beta в посредничестве фиброз 5.
Мы разработали метод к культуре Экс Vivo человек резекция образцы от пациентов DD для изучения взаимодействия между миофибробластов и окружающей ECM 5, 6. Исследование Д. соединительной ткани фиброза, а также другие фиброзные заболевания зависит от гистопатологический анализ Иссеченную хирургическое Образцы, изоляция фибробластов из ткани и создания первичных культур или процедур сортировки клеток. Эти подходы довольно статического, так как они не позволяют экзогенный манипулирование свойствами заболеваний или терапевтического вмешательства со стороны экспериментатора. Кроме того, первичный CELL культуры, как правило, адаптироваться к условиям культивирования и их свойства выражения гена по существу от ситуации в естественных условиях отличаются от всех прохода, даже во время ранних пассажах (среди проход 3 и 6) 7, 8. Мы сумели сохранить отходов хирургического материала в Экс Vivo условия культивирования в течение периода времени, что позволяет изучение конкретного пациента характеристики и скрининга анти-фиброзных или противовоспалительных соединений наркотиков.
Система основана на нитроцеллюлозную мембрану, которая позволяет контакт ткани со средой, но не с пластика, таким образом, предотвращая изменение ткани при присоединении, как ранее наблюдали при культивировании DD фибробласты, а также другие типы клеток 9. Нет коллагеновый гель или другой белок, ЕСМ подложки не требуется, так как сама по себе ДД ткани производит большое количество этих белков. Это выгодно для поддержания родного ECM микросреды и оборота грехаCE матричных субстратов являются важным регулятором архитектуры и функции 10, 11 ткани. Например, ECM белки, такие как фибронектин, ламинин и коллаген, могут влиять на передних и задних полярность фибробластов, как аналогично представленным на апикально-базальной полярности в эпителиальных клетках 12, 13 . поляризованных клетки имеют асимметричное распределение молекул внеклеточного который определяет миграцию клеток и экспрессию генов, например, α1β1 интегрин доступность на мембране влияет клеточную адгезию к типу коллагена 14. С Основная цель этой 3D модели было сохранить родной микросреду, не использовался искусственный ECM подложке матрицы.
Вкратце: резекции образцы равной степени сократить в стерильной среде и помещали на nitrocellular мембран. Если лечение управляются с помощью инъекции требуется ткани вводят после того как они были размещены на мембране. Если лечение не требует быть введены с помощью Injотражения, то соединение добавляют к культуральной среде (модифицированной Игла среде Дульбекко (DMEM), с 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)). Культуры поддерживали в течение не более десяти суток, после чего ткань фиксировали в 4% параформальдегида (PFA), обработанного с помощью 30% раствора сахарозы, вложенной в октябре соединения и хранили при -80 ° С, как описано ранее 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги культивирования Экс Vivo человеческой соединительной ткани немедленное использование ткани после хирургического удаления обеспечения жизнеспособности; Ткань должна оставаться в среднесрочной или физиологического раствора во все времена; поддерживать стер?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren’s disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren’s disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren’s disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren’s disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren’s disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren’s Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. r. u. i. t. h. o. f. -. Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren’s nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
