الإنسان دوبوترين<em> فيفو السابقين</em> الثقافة لدراسة Myofibroblasts وخارج الخلية مصفوفة التفاعلات

Summary

مرض دوبوترين (DD) هو مرض fibroproliferative من كف اليد. هنا، نقدم بروتوكول لعينات ثقافة الاستئصال الجزئي من DD في ثلاثي الأبعاد (3D) نظام الثقافة. مثل هذا النظام الثقافة على المدى القصير يسمح الحفاظ على هيكل 3D والخصائص الجزيئية للأنسجة متليفة.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

مرض دوبوترين (DD)، وهو مرض يسبب انثناء fibroproliferative حميدة دائمة العضوية في الأصابع بسبب تشكيل عقيدات والحبال في كف اليد. على الرغم من أن انتشار المرض مرتفع بشكل خاص بين القوقازيين من شمال أوروبا، والمسببات الوراثية الكامنة وراء هذا المرض ما زال مجهولا ^1. السمة الرئيسية للDD هو إنتاج فائض من المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات (مثل الكولاجين)، والتي تشكل النسيج الليفي الصعبة التي تحتل مساحة بين الأوتار والجلد من كف اليد والأصابع، وتعطيل حركات غرامة بشكل دائم من جهة ^{2، 3،} وتكرار المرض تشير التعديلات الوراثية الكامنة كسبب للتليف ^{1، 4.} علاج فعال يمكن أن يكون لاستهداف مباشرة الآليات تليفي لا يمكن السيطرة عليها على المستوى الخلوي والجزيئي.

وقد أدى عملنا مؤخرا على التليف بنا إلى تطويررواية نظام الثقافة 3D التي تسمح الثقافة على المدى القصير من أنسجة متليفة الإنسان مع إمكانية اختبار المخدرات. وقد ساعد هذا النظام على التغلب على نهج الحد من الثقافات الليفية 2D و تحديد دور لتنظيم أسفل جزئي، من خلال اكسون تخطي يتحقق، تفعيل مسار TGFβ في التوسط التليف ^5.

لقد قمنا بتطوير طريقة لثقافة فيفو السابقين العينات استئصال الإنسان من المرضى DD لدراسة التفاعل بين myofibroblasts وECM المحيطة ^{5 و 6.} وتعتمد دراسة DD تليف الأنسجة الضامة وكذلك الأمراض تليفي أخرى على تحليل الأنسجة من رفعه الجراحية العينات وعزل الخلايا الليفية من الأنسجة وإنشاء الثقافات الأولية أو إجراءات خلية الفرز. هذه المناهج هي ثابتة تماما لأنها لا تسمح التلاعب خارجي من خصائص مرض أو التدخل العلاجي من قبل المجرب. وبالإضافة إلى ذلك، CE الأساسيالثقافات ليرة لبنانية تميل إلى التكيف مع الظروف الثقافة والجينات خصائص التعبير عنها تختلف أساسا عن الوضع في الجسم الحي على كل مرور، حتى خلال الممرات الأولى (من بين مرور 3 و 6) ^{7، 8.} لقد نجحنا في الحفاظ على المواد الجراحية النفايات في السابق الظروف الثقافة الجسم الحي لفترة زمنية تسمح دراسة خصائص المريض محددة وفحص المركبات عقار مضاد للمتليفة أو المضادة للالتهابات.

ويستند هذا النظام على غشاء النيتروسليلوز الذي يسمح اتصال من النسيج مع المتوسط ​​ولكن ليس مع البلاستيك، وبالتالي، ومنع تغيير النسيج على المرفق، كما لوحظ سابقا عند زراعة الخلايا الليفية DD وكذلك أنواع الخلايا الأخرى ^9. لا يلزم جل الكولاجين أو غيرها من ECM البروتين الركيزة، منذ الأنسجة DD نفسها تنتج كميات كبيرة من هذه البروتينات. هذا هو مفيد لصيانة المكروية ECM الأم ودوران الخطيئةركائز م المصفوفة هي المنظم المهم العمارة الأنسجة وظيفة ^{10 و 11} على سبيل المثال، والبروتينات ECM مثل فبرونيكتين، laminin والكولاجين، قد تؤثر قطبية الأمامي الخلفي من الخلايا الليفية كما هو موضح بالمثل لقطبية قمية-القاعدية في الخلايا الظهارية ^{12، 13} . خلايا الاستقطاب لها توزيع غير متوازن من جزيئات الخلية والذي يحدد الهجرة الخلية والتعبير الجيني، على سبيل المثال، α1β1 الوصول إنتغرين على الغشاء يؤثر التصاق الخلية إلى النوع الأول من الكولاجين ^14. منذ كان الهدف الأساسي من هذا النموذج 3D للحفاظ على المكروية الأم، تم استخدام أي مصطنعة ECM مصفوفة الركيزة.

في سطور: يتم قطع العينات بتر قدم المساواة في بيئة معقمة ووضعها على الأغشية nitrocellular. إذا كان مطلوبا العلاج تدار عن طريق الحقن يتم حقن الأنسجة بعد أن يكونوا قد وضعت على الغشاء. إذا لا تتطلب العلاج إلى أن تدار عن طريق حقنةection ثم يضاف المركب إلى وسائل الإعلام الثقافة (Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM)، مع 1٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (P / S)). يتم الحفاظ على الثقافات لمدة أقصاها عشرة أيام وبعد ذلك يتم إصلاح الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA)، معالجتها من خلال 30٪ من محلول السكروز، جزءا لا يتجزأ في أكتوبر مركب وتخزينها في -80 ° C، كما هو موضح سابقا ^5.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع LUMC وAMC المبادئ التوجيهية من الإنسان لجنة أخلاقيات البحث. 1. إجراء العمليات الجراحية والأنسجة مجموعة ملاحظة: على الرغم من أن تقنيات مختلفة لالاستئصال الجراحي للانكماش دوبوت…

Representative Results

طريقة فيفو السابقين، والثقافة 3D من النسيج الضام هو انشاء نظام سهل وقوي لفهم العلاقة بين ECM ومكونات الخلايا الأخرى المكونة للنسيج DD وأنواع أخرى من المحتمل أن التليف كذلك. وعلاوة على ذلك يسمح هذا النظام طريقة موثوقة لاختبار آثار المركبات على أنواع مختلفة من الخلا?…

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية من زراعة الأنسجة الضامة الإنسان خارج الحي هي استخدام الفوري من الأنسجة بعد الاستئصال الجراحي لضمان جدوى. ينبغي أن يظل النسيج في محلول ملحي أو متوسطة في جميع الأوقات؛ الحفاظ على الثقافة العقيمة. يجب المقاطع العرضية من الأنسجة يكون الحد الأق?…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.