Umana Dupuytren di<em> Ex Vivo</em> Cultura per lo Studio dei miofibroblasti e matrice extracellulare Interazioni

Summary

Malattia di Dupuytren (DD) è una malattia fibroproliferativa del palmo della mano. Qui vi presentiamo un protocollo per i campioni della cultura di resezione di DD in un tridimensionale (3D) sistema di coltura. Tale sistema di coltura a breve termine permette conservazione della struttura 3D e proprietà molecolari del tessuto fibrotico.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

Malattia di Dupuytren (DD), una malattia benigna fibroproliferativa provoca la flessione permanente delle dita a causa della formazione di noduli e corde nel palmo della mano. Anche se la diffusione della malattia è particolarmente alta tra i caucasici del Nord Europa, l'eziologia genetica alla base della malattia resta sconosciuta ^1. La caratteristica principale del DD è l'eccesso di produzione di matrice extracellulare (ECM) proteine ​​(per esempio, collagene), che costituiscono un tessuto fibroso duro che occupa lo spazio tra i tendini e la pelle del palmo della mano e delle dita, interrompendo definitivamente i movimenti fini della mano ^{2, 3.} La ricorrenza della malattia suggerisce alterazioni genetiche sottostanti come causa di fibrosi ^{1, 4.} Un trattamento efficace potrebbe essere quella di indirizzare direttamente le incontrollabili meccanismi fibrotiche a livello cellulare e molecolare.

Il nostro recente lavoro sulla fibrosi ci ha portato allo sviluppo di unnuovo sistema cultura in 3D che permette di cultura a breve termine di tessuto fibrotico umano con il potenziale di test anti-droga. Questo sistema ha contribuito a superare l'approccio limitazione di colture di fibroblasti 2D e definire un ruolo per la regolazione giù parziali, raggiunti da exon skipping, di TGFβ attivazione della via nella mediazione fibrosi ^5.

Abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo campioni di resezione umano da pazienti DD di studiare l'interazione tra miofibroblasti e ECM circostante ^{5, 6.} Lo studio della fibrosi tessuto connettivo DD nonché altre malattie fibrotiche basa sull'analisi istopatologica del escisso chirurgica esemplari, l'isolamento dei fibroblasti del tessuto e la creazione di colture primarie o procedure di separazione delle cellule. Questi approcci sono alquanto statico in quanto non consentono la manipolazione delle proprietà esogena malattia o intervento terapeutico dallo sperimentatore. Inoltre, ce primariall culture tendono ad adattarsi alle condizioni di coltura e le loro proprietà di espressione genica differiscono sostanzialmente dalla situazione in vivo su ogni passaggio, anche durante i primi passaggi (tra il passaggio 3 e 6) ^{7, 8.} Siamo riusciti a mantenere il materiale chirurgico rifiuti ex vivo condizioni di coltura per un periodo di tempo che permette lo studio delle caratteristiche specifiche del paziente e lo screening di composti farmacologici anti-fibrotiche o anti-infiammatori.

Il sistema si basa su una membrana di nitrocellulosa che permette il contatto del tessuto con il mezzo, ma non con la plastica, quindi, impedendo l'alterazione del tessuto su di attaccamento, come precedentemente osservato quando la coltura fibroblasti DD così come altri tipi di cellule ^9. Non è richiesta alcuna gel di collagene o altro substrato proteine ​​ECM, poiché la stessa tessuto DD produce grandi quantità di queste proteine. Questo è vantaggioso per il mantenimento dei nativi microambiente ECM e il fatturato del peccatosubstrati matrice ce sono importante regolatore dell'architettura del tessuto e della funzione ^{10, 11.} Ad esempio, le proteine ​​ECM, come fibronectina, laminina e collagene, possono influenzare la polarità anteriore-posteriore fibroblasti come simile mostrati per polarità apicale-basale in cellule epiteliali ^{12, 13} . cellule polarizzate hanno una distribuzione asimmetrica di molecole extracellulari che determina la migrazione delle cellule e l'espressione genica, ad esempio, l'accessibilità α1β1 integrina sulla membrana colpisce adesione delle cellule al collagene di tipo I ^14. Dal momento che l'obiettivo primario di questo modello 3D è stato quello di preservare il microambiente nativo, è stato utilizzato alcun substrato matrice ECM artificiale.

In breve: campioni di resezione sono ugualmente tagliati in un ambiente sterile e posti su membrane nitrocellular. Se è richiesto un trattamento somministrato tramite iniezione i tessuti vengono iniettati dopo che sono state collocate sulla membrana. Se il trattamento non ha bisogno di essere amministrato via injezione poi il composto viene aggiunto al mezzo di coltura (Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM), con siero fetale di vitello 1% (FCS), 1% di penicillina-streptomicina (P / S)). Le colture vengono mantenute per un massimo di dieci giorni dopo che il tessuto è fissato in 4% paraformaldeide (PFA), elaborati attraverso soluzione di saccarosio al 30%, incorporato in OCT e conservati a -80 ° C, come descritto in precedenza ^5.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida LUMC e AMC di umana comitato etico della ricerca. 1. Procedura chirurgica e Tissue Collection Nota: Anche se esistono varie tecniche per l'asportazione chirurgica della contrattura di Dupuytren, il gold standard attuale è il fasciectomy parziali 15. La maggior parte dei pazienti sono trattati nella clinica day-surgery. Eseguire l'intervento chirurgico in anestesia generale o regionale in base a…

Representative Results

Il metodo di ex vivo, 3D coltura del tessuto connettivo è un sistema di set up semplice e robusto per comprendere la relazione tra ECM e altri componenti cellulari che costituiscono il tessuto DD e potenzialmente altri tipi di fibrosi pure. Inoltre questo sistema permette un metodo affidabile per testare gli effetti dei composti sulla differenti tipi cellulari ei loro effetti sul carico fibrotica 20. I passi da raccolta di materiale chirurgico rifiuti derivati ​​da f…

Discussion

Le fasi più critiche di coltura ex vivo tessuto connettivo umano sono l'uso immediato del tessuto dopo la rimozione chirurgica per garantire la redditività; il tessuto dovrebbe rimanere in soluzione salina media o in ogni momento; mantenere una cultura sterile; sezioni trasversali di tessuto devono avere spessore massimo di 200 micron; set up del sistema di coltura ex vivo è ottimale quando il tessuto è in contatto con il mezzo ma non completamente sommerso. Piano dovrebbe essere aggiunto solo …

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.