인간의 Dupuytren의<em> 전의 VIVO</em> 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화
Summary
Dupuytren의 질병 (DD)는 손바닥의 fibroproliferative 질환이다. 여기서는 3 차원 (3D) 배양 계에서 배양 DD로부터 표본을 절제 프로토콜을 제시한다. 이러한 단기 배양 시스템은 3 차원 구조의 보존과 섬유 성 조직의 분자 특성을 허용한다.
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Dupuytren의 질병 (DD)는 양성 fibroproliferative 질병으로 인해 손의 손바닥에 결절 및 코드의 형성에 손가락의 영구 굴곡이 발생합니다. 질병 확산 북유럽 백인 중에서도 특히 높지만 질환의 근본적인 유전 적 원인은 알려지지 않았다 하나. DD의 주된 특징은, 힘줄 및 손과 손가락의 손바닥의 피부 사이의 공간을 점유 거친 섬유 조직 형성 세포 외 기질 (ECM) 단백질 (예를 들면, 콜라겐)의 과잉 생산, 영구적 미세한 움직임을 방해 한편 (2)의 세. 질병의 재발 한 섬유증, (4)의 기본 원인으로 유전 적 변형을 의미한다. 치료 효과적인 직접 세포 및 분자 수준에서 제어 할 수없는 섬유 성 메커니즘을 타겟팅 할 수 있었다.
섬유증에 우리의 최근 작품은의 발전에 우리를 주도하고있다약물 테스트의 전위와 인간 섬유 성 조직의 단기 배양을 허용 신규 한 3 차원 배양 시스템. 이 시스템은 2D 섬유 아세포 배양 제한하는 접근 방식을 극복하고 섬유증 (5)을 매개로 TGFβ 통로 활성화의 엑손 스키핑에 의해 달성되는 부분 아래로 규제의 역할을 정의하는 데 도움이되었습니다.
우리는 DD 환자의 생체 인간의 절제 표본은 근섬유 사이의 상호 작용과 주변 ECM (5), (6)을 연구하는 문화 방법을 개발했다. DD 결합 조직 섬유화의 연구뿐만 아니라 다른 섬유 성 질환 수술 절제의 조직 병리학 적 분석에 의존 표본, 조직 및 차 문화 또는 셀 정렬 절차의 설립에서 섬유 아 세포의 분리. 그들은 실험에 의한 질병의 특성 또는 치료 개입의 외생 적 조작을 허용하지 않기 때문에 이러한 접근은 매우 정적입니다. 또한, 일차 CELL 문화는 배양 조건에 적응과 유전자 발현 특성도 초기 구절 동안 모든 통로에 본질적으로 생체 내 상황에서 다른 경향 (통로 (3) 사이에 6) 7, 8. 우리는에 폐기물 수술 재료를 유지 관리해야 특정 환자의 특성 연구 및 항 섬유 성 또는 항 염증성 약물 화합물의 스크리닝을 가능 기간에 대한 생체 외 배양 조건.
시스템은 DD 섬유 모세포뿐만 아니라 다른 세포 유형 (9)를 배양 할 때 이전에 관찰 된 바와 같이, 장착시에 조직의 변질을 방지하므로, 매질과 아닌 플라스틱과 조직의 접촉을 허용 니트로 셀룰로오스 막에 기초한다. DD 조직 자체가 단백질의 대량 생산 No를 콜라겐 겔 또는 다른 ECM 단백질 기판은 필요하지 않다. 이 기본 ECM 미세 환경 및 회전율 죄의 유지에 유리하다CE 매트릭스 기판은 조직 구조 및 기능 (10), (11)의 중요한 조절이다. 예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐과 같은 ECM 단백질, 마찬가지로 상피 세포 (12)에 정점 – 기저 극성 도시 섬유 아세포의 전후 극성, (13)에 영향을 미칠 수있다 . 편광 세포는 세포의 이동 및 유전자 발현, 예를 들어, 막에 α1β1 인테그린 접근성 내가 14 콜라겐 입력 세포 접착에 영향을 미치는 결정 세포 분자의 비대칭 분포를 가지고있다. 이 3D 모델의 주요 목표는 기본 미세을 보존 이었기 때문에, 인공 ECM 매트릭스 기판이 사용되지 않았다.
간단히 : 절제 표본 동등하게 무균 환경에서 절단 및 nitrocellular 세포막에 위치. 주사 투여를 통해 치료가 필요한 경우에 그들이 막 상에 배치 된 후에 조직을 주입된다. 치료는 INJ를 통해 투여 될 필요하지 않은 경우다음의 ection 화합물 (1 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 – 스트렙토 마이신 (P / S)와 함께, 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 배양 배지에 첨가한다. 이전 5 바와 같이 배양, 30 % 수크로오스 용액을 통해 처리 된 티슈는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정 된 이후 최대 10 일간,의 OCT 화합물에 매립하고 -80 ℃에서 보관 유지된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 생체 결합 조직 배양에서 가장 중요한 단계는 생존을 보장하기 위해 제거 수술 후의 조직의 즉시 사용이고; 조직은 항상 중간 또는 식염수 용액에 남아 있어야한다; 멸균 문화를 유지; 조직의 횡단면은 최대 200 μm의 두께를 가져야한다; 조직이 매체와 접촉 있지만 완전히 침수하지 않을 경우 체외 배양 시스템의 설정은 최적입니다. 보통은 작은 부피에서 트랜스 웰의 외측 챔버 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
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