Humano Dupuytren<em> Ex Vivo</em> Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Summary

Enfermedad de Dupuytren (DD) es una enfermedad fibroproliferativa de la palma de la mano. A continuación, presentamos un protocolo para muestras de resección cultura de DD en un sistema de cultivo en tres dimensiones (3D). Tal sistema de cultivo a corto plazo permite la preservación de la estructura 3D y propiedades moleculares del tejido fibrótico.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

Enfermedad de Dupuytren (DD), una enfermedad benigna fibroproliferativa provoca la flexión permanente de los dedos debido a la formación de nódulos y cordones en la palma de la mano. Aunque la propagación de la enfermedad es particularmente alto entre los caucásicos del norte de Europa, la etiología genética subyacente de la enfermedad sigue siendo desconocida ^1. La principal característica de DD es el exceso de producción de (ECM) proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), que forman un tejido fibroso duro que ocupa el espacio entre los tendones y la piel de la palma de la mano y los dedos, lo que altera permanentemente los movimientos finos de la mano ^{2, 3.} La recurrencia de la enfermedad sugiere alteraciones genéticas subyacentes como una causa de la fibrosis ^{1, 4.} Un tratamiento eficaz podría ser para apuntar directamente los mecanismos fibróticas incontrolables a nivel celular y molecular.

Nuestro trabajo reciente sobre la fibrosis nos ha llevado al desarrollo de unnovedoso sistema de cultivo 3D que permite cultivo a corto plazo de tejido fibrótico humano con el potencial de pruebas de drogas. Este sistema ha ayudado a superar el enfoque limitante de cultivos de fibroblastos 2D y definir el papel de la regulación a la baja parcial, logrado por la omisión de exón, de activación de la vía TGF en la mediación de la fibrosis ^5.

Hemos desarrollado un método para el cultivo ex vivo especímenes de resección humana de pacientes con DD para estudiar la interacción entre los miofibroblastos y la ECM circundante ^{5, 6.} El estudio de DD fibrosis del tejido conectivo, así como otras enfermedades fibróticas se basa en el análisis histopatológico de la extirpado quirúrgica especímenes, el aislamiento de los fibroblastos del tejido y el establecimiento de cultivos primarios o procedimientos de clasificación de células. Estos enfoques son bastante estática, ya que no permiten la manipulación exógena de las propiedades de la enfermedad o intervención terapéutica por el experimentador. Además, ce primariall culturas tienden a adaptarse a las condiciones de cultivo y sus propiedades de expresión de genes difieren esencialmente de la situación in vivo después de cada paso, incluso durante los primeros pasajes (entre el paso 3 y 6) ^{7, 8.} Hemos logrado mantener el material quirúrgico de residuos en ex vivo condiciones de cultivo para un periodo de tiempo que permite el estudio de las características específicas del paciente y el cribado de compuestos de fármacos anti-fibróticos o anti-inflamatorios.

El sistema se basa en una membrana de nitrocelulosa que permite el contacto del tejido con el medio, pero no con el plástico, por lo tanto, la prevención de la alteración del tejido tras la unión, como ya se observó cuando el cultivo de fibroblastos DD, así como otros tipos de células ^9. No se requiere gel de colágeno u otro sustrato de proteínas ECM, ya que el propio tejido DD produce grandes cantidades de estas proteínas. Esto es ventajoso para el mantenimiento de la microambiente ECM nativa y sin rotaciónsustratos de matriz ce son importantes regulador de la arquitectura y la función ^{10, 11} tejidos. Por ejemplo, las proteínas ECM como la fibronectina, laminina y colágeno, pueden influir en la polaridad delantero-trasero del fibroblastos mostradas como igualmente para la polaridad apical-basal en las células epiteliales de ^{12, 13} . células polarizadas tienen una distribución asimétrica de moléculas extracelulares que determina la migración celular y la expresión génica, por ejemplo, la accesibilidad de la integrina α1β1 en la membrana afecta a la adhesión celular a colágeno de tipo I ^14. Puesto que un objetivo principal de este modelo 3D era preservar el microambiente nativo, no se utilizó sustrato matriz ECM artificial.

En resumen: los especímenes de resección son igualmente cortados en un ambiente estéril y se colocaron en membranas nitrocellular. Si se requiere un tratamiento administrado a través de la inyección de los tejidos se inyectan después de que se han colocado en la membrana. Si el tratamiento no requiere ser administrado a través de injección entonces el compuesto se añade al medio de cultivo (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), con 1% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de diez días después de que el tejido se fija en 4% de paraformaldehído (PFA), procesado a través de solución de sacarosa al 30%, embebidos en compuesto OCT y se almacenaron a -80 ° C, como se describió previamente ^5.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices LUMC y AMC de comité de ética de investigación humana. 1. Procedimiento Quirúrgico y Tejidos Colección Nota: A pesar de que existen diversas técnicas para la extirpación quirúrgica de la contractura de Dupuytren, el actual estándar de oro es la fasciectomía parcial 15. La mayoría de los pacientes son tratados en el hospital de día de la cirugía. Hacer una cirugía con anestesia general o regi…

Representative Results

El método de la ex vivo, la cultura 3D de tejido conectivo es un conjunto de hasta sistema fácil y robusto para comprender la relación entre ECM y otros componentes de las células que constituyen el tejido DD y potencialmente otros tipos de fibrosis, así. Además, este sistema permite un método fiable para probar los efectos de los compuestos sobre diferentes tipos de células y sus efectos sobre la carga 20 fibrótica. Los pasos de la colección de material de dese…

Discussion

Los pasos más críticos de cultivo de tejido conectivo ex vivo humano son el uso inmediato del tejido después de la extirpación quirúrgica para asegurar la viabilidad; el tejido debe permanecer en solución del medio o solución salina en todo momento; mantener un cultivo estéril; secciones transversales de tejido deben tener un grosor máximo de 200 micras; configurar el sistema de cultivo ex vivo es óptima cuando el tejido está en contacto con el medio, pero no completamente sumergido. Medio d…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.