Summary
De ziekte van Dupuytren (DD) is een fibroproliferatieve ziekte van de palm van de hand. Hier presenteren we een protocol om de cultuur resectiepreparaten van DD in een driedimensionale (3D) cultuur systeem. Een dergelijke tijdelijke kweeksysteem maakt behoud van de 3D structuur en moleculaire eigenschappen van het fibrotische weefsel.
Introduction
Ziekte van Dupuytren (DD), een goedaardige fibroproliferatieve ziekte veroorzaakt permanente buiging van de vingers door de vorming van nodules en koorden in de palm van de hand. Hoewel de verspreiding van de ziekte is vooral hoog onder blanken van Noord-Europa, de onderliggende genetische etiologie van de ziekte is nog onbekend 1. Het belangrijkste kenmerk van DD de overproductie van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten (bijvoorbeeld collageen), die een taai vezelig weefsel bezetten de ruimte tussen de pezen en de huid van de handpalm en vingers vormen permanent verstoren van de fijne bewegingen van de hand 2, 3. De terugkeer van de ziekte suggereert onderliggende genetische veranderingen als oorzaak van fibrose 1, 4. Een effectieve behandeling kan direct richten oncontroleerbare fibrotische mechanismen op cellulair en moleculair niveau.
Onze recente werkzaamheden fibrose heeft geleid tot de ontwikkeling van eenroman 3D-cultuur systeem dat op korte termijn de cultuur van de menselijke fibrotische weefsel mogelijk maakt met het potentieel van de dopingcontrole. Dit systeem heeft bijgedragen tot het beperken benadering 2D fibroblastculturen overwinnen en een rol voor de gedeeltelijke neerregulatie bereikt door exon skipping van TGFp route activatie bij het mediëren fibrose 5 definiëren.
We hebben een werkwijze cultuur ex vivo humane resectiepreparaten van DD patiënten om de interactie tussen myofibroblasten en het omliggende ECM 5, 6 kunnen onderzoeken. De studie van DD bindweefsel fibrose en andere fibrotische ziekten gebaseerd op histopathologische analyse van de uitgesneden chirurgische exemplaren, isolatie van fibroblasten uit het weefsel en de vestiging van primaire culturen of celsorteren procedures. Deze benaderingen zijn vrij statisch omdat zij geen exogene manipulatie van de ziekte eigenschappen of therapeutische interventie door de experimentator mogelijk. Daarnaast primaire cell culturen hebben de neiging zich aan te passen aan de omstandigheden cultuur en hun genexpressie eigenschappen verschillen wezenlijk van de in vivo situatie bij elke passage, zelfs tijdens de vroege passages (onder passage 3 en 6) 7, 8. We zijn erin geslaagd om het afval chirurgisch materiaal in stand te houden ex vivo kweekcondities gedurende een tijdsperiode die studie van de patiënt-specifieke kenmerken en screening van anti-fibrotische of anti-inflammatoir geneesmiddel verbindingen toestaat.
Het systeem is gebaseerd op een nitrocellulosemembraan dat contact van het weefsel met het medium, maar niet met de kunststof maakt dus het voorkomen van de wijziging van het weefsel na bevestiging, zoals eerder waargenomen wanneer kweken DD fibroblasten en andere celtypen 9. Nr collageengel of andere ECM eiwitten substraat vereist, aangezien de DD weefsel zelf produceert grote hoeveelheden van deze eiwitten. Dit is voordelig voor het onderhoud van natieve ECM micromilieu en omzet since matrix substraten belangrijke regulator van weefselarchitectuur en functie 10, 11. Zo ECM eiwitten zoals fibronectine, laminine en collageen, kunnen voor- achterzijde polariteit van fibroblasten zoals eveneens getoond apicale-basale polariteit in epitheliale cellen 12, 13 beïnvloeden . gepolariseerde cellen hebben asymmetrische verdeling van extracellulaire moleculen die celmigratie en genexpressie, bijvoorbeeld α1β1 integrine toegankelijkheid van het membraan beïnvloedt cel adhesie aan type I collageen 14 bepaalt. Aangezien een primaire doelstelling van deze 3D-model was de natieve micro behouden, werd geen kunstmatige ECM matrix substraat.
Kortom: resectiepreparaten gelijkelijk gesneden in een steriele omgeving en op nitrocellular membranen. Indien behandeling toegediend via injectie vereist het weefsel worden geïnjecteerd nadat deze op het membraan geplaatst. Als de behandeling niet behoeft te worden toegediend via injectie wordt de verbinding toegevoegd aan het kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 1% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine (P / S)). De kweken worden gedurende maximaal tien dagen waarna het weefsel gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA), behandeld met 30% sucrose-oplossing, ingebed in OCT verbinding en bewaard bij -80 ° C, zoals eerder beschreven 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt het LUMC en het AMC richtlijnen van het menselijk onderzoek ethische commissie.
1. chirurgische ingreep en Tissue Collection
Opmerking: Hoewel de verschillende technieken voor chirurgische excisie van contractuur van Dupuytren bestaat, de huidige gouden standaard is de gedeeltelijke fasciectomie 15. De meeste patiënten worden behandeld dag chirurgie kliniek.
- Voeren een operatie onder algehele of regionale anesthesie volgens de voorkeuren patiënt en anesthesioloog's en co-morbiditeit van de patiënt. Deze overwegingen vallen buiten het bestek van dit artikel. Voorafgaand aan de incisie, raakt de huid met een scherp voorwerp om te controleren of de anesthesie is bevredigend. Gebruik een tourniquet om chirurgische visualisatie in een bloedeloze gebied te vergemakkelijken.
- Na steriel prepping en draperen, markeren de verwachte incisie met een pen. Insnijden van de huid met een scalpel onder de loupe vergroting ofwel lengterichting or behulp zigzag incisies om extra contracturen te voorkomen en ook om te zorgen voor voldoende blootstelling.
- Met behulp van schaar dissectie, bevrijden de huid en de onderhuidse laag van de onderliggende gecontracteerd fascia palmaris. Identificeren en te beschermen de neurovasculaire bundel van de vinger omdat de zieke snoer kan verplaatsen in de richting van de middellijn. Zodra de fibrotische weefsel (knobbeltje en / of koord) wordt geschetst, accijnswetgeving scherp en regionaal (subtotaal) met behulp van een scalpel. Voer zorgvuldige hemostase onder tourniquet controle aan het eind van de procedure hematoom te voorkomen.
- Om de huid te sluiten, gebruik dan extra Z-plasties gedeeltelijke verlenging van de huid te verkrijgen.
- Voor deze studies alleen het gezwel gedeelte van de fibrotische koord, de meest actieve en cellulaire deel van de ziekte. Hebben de chirurg te voeren macroscopische identificatie. De geïsoleerde knobbeltjes in de palm van de hand zijn vaak voorlopers of een koord, maar worden nauwelijks gereseceerd, omdat ze doorgaans geen symptomen veroorzaken.Degene die we gereseceerd waren de knobbeltjes die deel uitmaken van een koord van de gecontracteerde vinger waren. Identificeer deze knobbeltjes door de harde dikke deel van de koorden in de handpalm (figuur 1A).
- Zodra de chirurg verwijdert het weefsel onmiddellijk overbrengen met steriele forceps aan een 50 ml buis met DMEM medium aangevuld met 10% FCS en 1% (P / S). Houd het weefsel maximaal 2 uur in dit medium op een doos nat ijs (4 ° C) (bijvoorbeeld transport van het weefsel van de operatiekamer aan de celkweek faciliteit).
- Houd de monsters op nat ijs (4 ° C) tijdens de voorbereiding voor de volgende stap. Bereiding van de materialen en celcultuurkamer nodig 10-20 min.
2. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Medium en Culture Inserts
Opmerking: Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij specifiek vermeld.
- Maak 500 ml DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% (P / S) en filter sterilize. Voorverwarmen het medium bij 37 ° C.
- Autoclaaf pincet, een paar gebogen bladen Mayo schaar (150-170 mm lang) en een paar Metzenbaum schaar en op te slaan in een steriele container.
- Onder laminaire stroming, opent een steriele 12-well plaat cultuur. Plaats een kweekinsertie (0,45 urn poriegrootte, diameter 12 mm) in elk putje van de 12-well plaat (Figuur 1B, onderste paneel).
- Vul het 12-well plaat met 600 ul voorverwarmde (37 ° C) kweekmedia gepipetteerd op de put en niet direct op het membraan van het inzetstuk. Plaats de plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO2) (Figuur 1B, bovenste paneel).
- Alternatief, gebruik een 24-wells plaat en voeg 300 pl medium per well. Het volume medium per put is optimaal wanneer een meniscus wordt gevormd tussen de vloeistof en het onderste gedeelte van het membraan insert.
Opmerking: het medium bij de bodem van de put diffundeert door de nitrocellulose Membrane vormen van de meniscus laag zoals weergegeven in schema's van figuur 1B (onderste paneel).
- Alternatief, gebruik een 24-wells plaat en voeg 300 pl medium per well. Het volume medium per put is optimaal wanneer een meniscus wordt gevormd tussen de vloeistof en het onderste gedeelte van het membraan insert.
3. Tissue Voorbereiding en ex vivo Tissue Culture Setup
Opmerking: Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij specifiek vermeld.
- Breng de knobbel deel van het snoer van de 50 ml buis op een 100 mm petrischaal en voeg 10 ml van de voorverwarmde (37 ° C) medium. Zorg ervoor dat het weefsel in contact is met de vloeistof tijdens de gehele procedure.
- Verwijder de perinodular vetlaag met de Metzenbaum schaar. Gooi het vetweefsel. Met behulp van forceps en de gebogen bladen schaar, knippen dwars het weefsel in kleinere stukken (maximale dikte van 200 um).
- Breng de 12-well plaat uit de incubator naar de laminaire afzuigkap. Controleer het membraan van het inzetstuk transparante (nat) is geworden en derhalve in contact met het medium.
- Behulp van een tangtil een tissue deel door het aanraken van de buitenste laag (niet van toepassing spanning op het weefsel). Plaats een tissue deel op het membraan van de cel cultuur insert, zodat het weefsel blijft in de lucht-medium interfase. Culture maximaal twee weefseldelen op hetzelfde insert / putje.
- Zorg ervoor dat het weefsel vlak wordt geplaatst op het membraan, in de lengterichting contact met het medium, zodanig dat het weefsel noch drijft uit het membraan noch wordt volledig gedekt door medium. Vermijd luchtbellen.
Opmerking: In dit stadium is het mogelijk om groeifactoren en remmers van belang om de media aan; Zo testverbindingen (A, B, C, D, E) replicaten en / of concentratie curve. Ten minste 2 controle (onbehandelde) stukjes weefsel onder normale groeiomstandigheden zodat het experiment is goed ingesteld. Incubeer weefsels voor 3-7 dagen in een weefselkweek incubator. - Infecteren het weefsel met ofwel lentivirale of adenovirale construct als overexpressie of knock down experiments van een gen-van-belang moeten worden (figuur 2). Breng een weefsel gedeelte van de 12-well plaat in een 35 mm schaal met behulp van een tang.
- Gebruik een maximaal volume van 10 ui hoge titer virus.
- Voer de injectie onder een dissectie microscoop met een insuline spuit geladen met 50 pl PBS dat 10 ul van het geselecteerde virus. Plaats de naald loodrecht op het midden van het weefsel.
- Injecteer langzaam de inhoud van de spuit. Raak de naald niet direct terug te trekken. Wanneer aanprikken het weefsel, laat de naald gaan via de andere kant, maar de naald in het weefsel zelf (rond het midden van het weefsel) te behouden.
- Breng het weefsel terug in de 12-well plaat, sluit de kweekplaat en plaats deze in de incubator (37 ° C, 5% CO2).
4. Whole-mount immunofluorescentiekleuring en 3D-reconstructie
Opmerking: Alle proprocedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij specifiek vermeld. Het protocol voor de ganse berg immunostaining en beeldvorming hieronder beschreven is een aanpassing van de eerder gerapporteerde methoden die worden gebruikt voor andere weefsels 16-19. Buffers en materialen worden beschreven in Tabel 1 en Materialen lijst.
- Transfer weefsels van de cultuur plaat tot 2 ml microcentrifugebuisjes met PBS. Was 2x gedurende 5 min in PBS oplossing op een roterend platform. Fix weefsels in 4% gebufferde PFA (1,5 ml oplossing per weefsel in 2 ml microcentrifuge buizen) O / N bij 4 ° C op een roterend platform.
- Verwijder PFA en was 3x in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Dehydrateer weefsels door onderdompeling in een 25% methanoloplossing 2 uur bij kamertemperatuur op een roterend platform. Verhoog geleidelijk de methanol percentage (50%, 75%, 100%) met de weefsels ondergedompeld in elke oplossing 2 uur bij kamertemperatuur op een roterend platform.
- Transfer weefsels in DMSO / methanoloplossing (permeabilisatie stap) gedurende 3 weken bij 4 ° C,zoals eerder 18 beschreven.
Opmerking: In dit stadium kan weefsel worden opgeslagen op lange termijn in 100% methanol bij -20 ° C. - Doorgaan met kleuringsprocedure 16, 17; geleidelijk hydrateren weefsels (75% -50% -25% -0% methanol serie). Voer elke rehydratatietrap 2 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder constant roeren.
- Incubeer monsters met primaire antilichamen in PBS dat 1% runderserumalbumine (BSA) en 20% DMSO O / N bij 4 ° C. Gebruik antilichamen op de volgende verhoudingen met de handelsvoorraden in PBS: anti-α gladde spier actine (1: 500, muis), anti-collageen type I (1: 500, geit), anti-collageen type III (1: 500, geit).
- Was uitgebreid in PBS gedurende 48 uur bij 4 ° C (verandering PBS oplossing 3 tot 4 maal).
- Verdun geschikte secundaire antilichamen (Alexa 555 anti-muis Alexa 488 anti-geit) bij 1: 250 verdunning in PBS bevattende 1% (BSA) en 20% DMSO. Incubeer O / N bij 4 ° C.
- Was uitgebreid in PBS gedurende 48 uur bij 476, C en incubeer nucleaire tegenkleuring, TO-PRO-3 1: 500 verdund in PBS bij de laatste wasstap.
Opmerking: TO-PRO-3 is een ver-rood uitstralende DNA kleurstof (met een He-Ne 633 nm laser lijn) en wordt gecombineerd voor gelijktijdige beeldvorming met andere kanalen; in dit geval collageen type I / collageen type III (488 nm), α gladde spier actine (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Breng het weefsel een reeks methanol (25% -50% -75%) langzaam uitdrogen van het weefsel; voeren elk dehydratatiestap 2 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder constant roeren.
- Transfer weefsels in polypropyleen buisjes. Duidelijke weefsels in methylsalicylaat (hendel onder chemische afzuigkap) 18 of als alternatief gebruik BABB oplossing 19. Incubeer bij kamertemperatuur onder constant roeren totdat de weefsels transparant. Mount tussen een glijbaan en een dekglaasje verzegeld met harde set montage medium (figuur 1C, bovenste paneel).
- Afbeelding samples op een omgekeerde confocale microreikwijdte uitgerust met een hoge NA 63X en / of 100x olie-immersie doelstellingen (figuur 1C).
- Reinig de lens met schoonmaken oplossing die door de microscoop fabrikant.
- Breng een druppel olie op de objectieflens. Plaats de dia met het model op de microscoop podium en focus op het monster.
- Stel de configuraties op de microscoop voor gelijktijdige beeldvorming van drie kanalen fluorescentie met laserlijnen 488 nm, 514 nm en 633 nm.
- Verwerven enkele XY beelden of meerdere focal plane beelden (Z-stack) (Figuur 3A). Gebruik toegenomen breedte van Z-stack voor het uitvoeren van 3D-reconstructie. Voor het verkrijgen van een afbeelding met hoge resolutie gebruiken lage scansnelheid, gemiddeld aantal scans (≥ 3) en het verwerven van 16-bits beelden van 1024 x 1024 pixel resolutie.
- Analyseer de Z-stack verkregen beelden: eerst een andere naam geven en opslaan beeldbestand (xyz). Met behulp van het softwareprogramma van de confocale microscoop, configureert u een maximale intensiteit projectie van de Z-stack beelden in een 3D gereconstrueerde afbeelding.
- Selecteer de xyz-bestand, in de "Process Tools" op onder "Visualisatie" en "3D-projectie". Enter "Maximum" in de projectiemethode (of "gemiddeld" indien het fluorescentiesignaal is verzadigd). Voor een uitsteeksel niet de X, Y en Z overstappen en het uitsteeksel gereedschap (figuur 3B, r1) toepassen.
- Gebruik de Z-stack beelden naar een 3D-projectie met animatie (confocale software) te creëren voor het bekijken doeleinden. Selecteer de xyz-bestand, in het proces van Extra, klik onder "Visualisatie" en "3D-projectie".
- Klik op "Film maken". Voer de Start Rotatie hoek in graden (bijvoorbeeld 0 ° als uitgangspunt van de film, Y-as) en klik op "Set Start". Voer het einde draaihoek in graden (Y-as) als eindpunt van de film (bijvoorbeeld, 180 ° of 3606; voor een volledige rotatie) en klik op "Set End".
- Selecteer "maximum" als projectiemethode (of "gemiddeld" indien het fluorescentiesignaal is verzadigd). Voer de "Aantal Frames" voor de rotatie van de 3D-reconstructie (bijvoorbeeld 20 omwentelingen of hoger om de rotatiesnelheid te verminderen). Klik op "Apply". De film te exporteren als visuele bestand (bijvoorbeeld "avi") (aanvullende Film 1) of exporteren als "tiff" bestand dat een beeldbestand voor elke draaihoek creëert (figuur 3B; rotatie r4, r10, r18).
5. Gecombineerde tweede harmonische generatie (collageen) en twee-foton Opgewonden Fluorescentie (elastine) Imaging op ex vivo weefsel tijdens Cultuur
Opmerking: Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij specifiek vermeld.
- Verwijder transwell platen uit incubator en plaats een enkel (niet vastgelegde) tissue deel aan een 35 mm celcultuur plaat met 500 ul van medium.
- Plaats het weefsel zodat de lange as plat op de plaat. Houd weefsel nat te allen tijde echter niet drijven.
- Plaats-water ondergedompeld doelstelling van de multifoton microscoop rechtstreeks in contact met het weefsel (figuur 1C).
- Verkrijgen beelden met een excitatie golflengte van 800 nm en het verzamelen van uitgezonden licht tussen 371-425 nm (SHG, collageen) en 474-532 nm (autofluorescence, elastine) (Figuur 3C). Voer twee-foton microscopie in een rechtopstaande confocale microscoop uitgerust met een femtoseconde laser met behulp van een 20X / 1.0 NA water-immersie objectief. Proces confocale stapels software fabrikant.
Opmerking: excitatie met een nabij-infrarood laser van collageen moleculen zorgt voor een hoge contrast beeldvorming van inheemse collageen structuren in verschillende dieptes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De werkwijze ex vivo 3D cultuur van bindweefsel is een eenvoudige en robuuste opstelling systeem om de relatie tussen ECM en andere celbestanddelen die de DD weefsel en mogelijk andere vormen van fibrose begrijpen ook. Bovendien laat dit systeem een betrouwbare methode om de effecten van verbindingen op verschillende celtypes en hun effecten op de fibrotische belasting 20 testen.
De stappen van het verzamelen van chirurgisch afval materiaal van Dupuytren fibrose, de assemblage van de kweekkamer en voorbeelden van analyse-instrumenten zijn weergegeven in Figuur 1. Zoals weergegeven in figuur 1, deze werkwijze verschaft een experimenteel hulpmiddel voor grote schermen drug schermen, bijvoorbeeld, antifibrotisch drug verbindingen alsmede de studie van ECM modellering in real-time en reproduceerbare wijze. Nodulaire delen van het fibrotische koord zijn even gesneden en geplaatst in transwell platen; elk weefsel deel (100-200 urn) wordt gekweekt bovenop de membraan van een kweek inzetstuk (0,45 urn poriegrootte, 12 mm diameter). Kweekmedium wordt toegevoegd aan de onderste kamer, zodat contact met het weefsel door het membraan. Gemiddeld 30-40 weefseldelen kunnen worden afgeleid uit een resectie specimen, die grootschalige screening van geneesmiddelen mogelijk maakt; verbindingen, kleine moleculen of groeifactoren. Proeven omtrent de concentratie en / of tijd-afhankelijk effect van geneesmiddelen haalbaar.
Zoals getoond in figuur 2, kan genexpressie worden gemanipuleerd (overexpressie / neerslaan) door het gebruik van adeno / lentivirussen rechtstreeks geïnjecteerd in het weefsel. Fluorescent gelabelde virale transductie wordt uitgevoerd in frisse dikke weefselmonsters door injectie. Weefsel blijft in de cultuur voor 24-48 uur na injectie en vervolgens wordt gefixeerd, embedded en coupes in 0,7 micrometer cryosecties. Bovendien, om het effect van verschillende verbindingen of kweekomstandigheden het weefsel deel analyserens zijn bevestigd en onderworpen aan volledige mount immunofluorescentie zoals getoond in figuur 3. 3D beeldvorming van dikke weefsel gebeurt door confocale microscopie (Figuur 3A-B). Een andere methode is de live 3D-imaging op weefsels in kweek gehouden; endogene collageen remodeling wordt bestudeerd real-time in vers ontleed, niet-vaste weefsel delen door tweede harmonische generatie (SHG) (Figuur 3C). Het effect van potentiële anti-fibrotische middelen wordt ook gevolgd delen van hetzelfde weefsel op verschillende tijdstippen. Collageen structuren van dikke weefsel worden afgebeeld met behulp van SHG in een rechtopstaande multifoton microscoop. Tijdens de beeldvorming, worden weefselmonsters in medium geplaatst en worden afgebeeld met een water-immersie objectief. Na beeldvorming, kunnen de weefsels worden overgebracht naar het kweeksysteem. Effecten kunnen worden bestudeerd op het niveau van de cellulaire en extracellulaire milieu verstrekken van een voordeel ten opzichte van in vitro cel-gebaseerde testen. Er zijn meerdere mogelijkheden voor analysis van biologische effecten zoals histologie van vaste weefselsecties, geheel mount immunofluorescentie en 3D reconstructie beeldvorming door confocale microscopie, SHG en twee-foton aangeslagen fluorescentie beeldvorming van endogeen collageen en elastine. Enkele voordelen van de SHG beeldvorming het gebruik van verse, niet-vaste weefsels, dat zonder antilichaam kleuring voorbereiding vereist en dat hetzelfde weefsel meerdere keren worden belicht (tijdsverloop bij kweekomstandigheden). SHG en twee-foton aangeslagen fluorescentie beeldvorming is eerder beschreven spier- en bindweefsel 21-23 en ongekleurde arteriële wand structuur 24 echter hier rapporteren we een alternatieve toepassing voor de studie van Dupuytren fibrose.
Figuur 1. Schema van ex vivo 3D weefselkweek systeem. (A) DD permanente flexiecontractuur in de hand van een patiënt voorafgaand aan de chirurgische verwijdering. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerdere studie 5. (B) Voorbeeld van ex vivo cultuur opgezet. (C) Voorbeelden van experimentele benaderingen die kunnen worden gebruikt voor de analyse van ECM-depositie. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Proof-of-principle ex vivo viraal-gemedieerde genexpressie modulatie in hele berg weefsel. (A) Kernen worden gevisualiseerd met TO-PRO-3 kleurstof (blauw). Bars 75 urn. (B) Directe visualisatie van de fluorescentekleurstof DsRed (rood), post-injectie met adenovirus-DsRed. Bars 75 micrometer. (C) Samengevoegd image (nucleaire kleuring in blauw, DsRed in het rood). Cytoplasmatische lokalisatie van DsRed aangeeft adenovirale levering in de cellen binnen 24 uur. Bars 75 micrometer. (DF) Lentivirale transductie. (D) Kernen worden gevisualiseerd met TO-PRO-3 kleurstof (blauw). Bars 25 urn. (E) Directe visualisatie van GFP in weefselsecties (groen), na injectie met Lenti-GFP deeltjes. Bars 25 pm. (F) Samengevoegd beeld van D en E aangeeft intracellulaire lokalisatie van Lenti-GFP. Bars 25 pm (GH) Voorbeeld van lentivirus-gemedieerde knockdown tegen interessante gen (aangeduid als "A"). (G) Lentivirus dragen gecodeerd shRNA sequentieex vivo werd geïnjecteerd in het weefsel. Immunofluorescentie kleuring voor eiwit van belang (aangeduid als "A") worden in rood. Bars 75 urn. (H) Lentivirus dragende gen A-shRNA sequentie werd ex vivo geïnjecteerd in het weefsel. Immunofluorescentie kleuring voor eiwit "A". Kernen zijn gekleurd met TO-PRO-3 kleurstof. Bars 75 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. 3D reconstructie beeldvorming, tweede harmonische generatie en twee-foton aangeslagen fluorescentie beeldvorming. (A) 3D beeldvorming door confocale microscopie. Single (xy) beelden in brandpuntsvlakken langs verschillende weefsel diepten (z = 50-200 micrometer). Ganse berg IMMUnofluorescence vlekken; myofibro- marker α-gladde spier actine (αSMA, rood), nucleaire kleuring (TO-PRO-3, blauw). Bars:. 500 pm (B) 3D gereconstrueerd image (Z stapel 389 micrometer) van RAW-afbeeldingen, zoals aangegeven in panel Een op verschillende 3D-rotaties aangegeven als "r1", "r4", "r10", "R18". Bars 500 micrometer. (C) Endogene collageen inhoud modellering door tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming in verse, dikke weefsel delen (linker paneel, groen). Twee-foton aangeslagen fluorescentie (TPF) van elastine structuren van de ECM werd gevangen genomen door multifoton microscopie (middelste paneel, red). Samengevoegde afbeelding van collageen (groen) en elastine (rood) (rechter paneel). Bars:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende Film 1. vertegenwoordiwoordiger 3D-reconstructie-film van Dupuytren ganse berg weefsel confocale beeldvorming van DD weefsel werd uitgevoerd na zeven dagen ex vivo cultuur en verwerking voor ganse berg immunofluorescentiekleuring.; myofibro- marker α-gladde spier actine (αSMA, rood), nucleaire kleuring (TO-PRO-3, blauw). Schaal bar = 500 micrometer. Frames = 20. Z = 389 micrometer. Klik hier om deze video te bekijken.
| PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) | 8,00 g NaCl (0,137 M) 0,20 g KCl (2,7 mM) 0,20 g KH 2PO 4 (1,1 mM) 0,10 g MgCl2 · 6H 2 O (0.5 mM) 2,16 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8.1 mM) 0,10 g watervrij CaCl2 (0,9 mM) H 2 O tot 1 L |
| Los 4 g paraformaldehyde in een kolf met 100 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de zuurkast, bedekken de kolf. Plaats de kolf op een verwarming / roeren blok en roer voorzichtig de oplossing. Controleer de temperatuur zodat een maximum 65 ° C bereikt. Vermijd oververhitting. Zodra de paraformaldehyde is opgelost en de oplossing helder lijkt, zet het vuur uit, maar laat te roeren. Niet hanteren om veiligheidsredenen. Laat afkoelen. Na afkoeling aliquot de oplossing en opslaan op lange termijn in -20 ° C vriezer of in een 4 ° C koelkast maximaal een week. | |
| BSA (runderserumalbumine), 10% (w / v) | Los 10 g BSA in 100 ml H2O Filter steriliseren met behulp van een lage eiwitbinding 0,22-um filter. Bewaar bij 4 ° C. |
| DMSO / Methanol (20%) permeabilisatie oplossing | Meng Dimethylsulfoxide metMethanol (1: 4 analogieën, totaal volume 100 ml). |
Tabel 1. Bufferoplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen van het kweken van ex vivo humane bindweefsel zijn het onmiddellijke gebruik van het weefsel na operatieve verwijdering van de levensvatbaarheid te waarborgen; het weefsel moet in medium of zoutoplossing allen tijde; onderhouden van een steriele cultuur; dwarsdoorsneden van weefsel moet maximaal 200 urn dikte; instellen van de ex vivo kweken systeem optimaal wanneer het weefsel in contact met het medium, maar niet geheel onder water. Medium worden toegevoegd alleen aan de buitenkant van de kamer transwell in een klein volume (bijvoorbeeld 500-600 ul per 12-well plaat oppervlak).
Bindweefsel afgeleid van Dupuytren is verstrikt in een taaie structuur met een hoog gehalte van ECM eiwitten zoals collageen, proteoglycanen en elastine; Vanwege deze eigenschappen en bovendien vanwege myofibroblast contractuur kan een uitdaging door het weefsel te snijden. Het is belangrijk om goede chirurgische instrumenten gebruiken; gebogen bladed Mayo schaar voor grotere delen in gelijke dikte en kleinere chirurgische schaar voor kleine weefseldelen (bijvoorbeeld wanneer meer weefseldelen nodig gebruik 24 putjes).
Werkwijzen voor de studie van DD zijn histopathologische analyses van de uitgesneden fibrotische monster of afleiding van primaire fibroblasten. Cel afleiding van de patiënt materiaal wordt gedaan is op twee manieren; in één van de werkwijzen, weefseldelen gekweekt in plastic kweekplaten gedurende een aantal weken tot er uitgroei van fibroblasten. De tweede methode is enzymatische behandeling van weefsel met collagenase en trypsine. De eerste methode is tijdrovend, zijn fibroblast eigenschappen veranderen door kweekomstandigheden en er doorgang variabiliteit tussen passages van dezelfde cellijn. De enzymatische werkwijze is sneller en kan worden gebruikt voor celsortering assays echter in vitro onderhouden van deze cellen uit de aangeboren ECM geeft niet de in vivo 25 (namelijk mechanoregulation en mechanotransduction). Verlies van spanning leidt demontage van αSMA vezels MFBS in korte tijd 26. De overvloed aan αSMA in de ex vivo 27, 28. Wat technische en biologische variabiliteit onze methode reproduceerbaar (levensvatbaarheid, ECM netwerk) en minder vatbaar voor wijziging weefsel door korte tijd cultuur. Bijvoorbeeld, de wijze van fibroblast uitgroei vereist een aantal weken die biochemische veranderingen kunnen veroorzaken (bv accumulatie van genetische mutaties, replicatieve senescentie). Echter, patiënt-specifieke genetische eigenschappen en biologische variabiliteit per se uitdagingen op het onderzoeksgebied DD en kunnen niet worden aangepakt met een van de bestaande methoden.
Zoals weergegeven in dit protocol, fibrotische DD exemplaren na operatieve verwijdering direct gekweekt in de ex vivo 3D-systeem en / of snel bevroren. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag modificatie van het weefsel mogelijk door toevoeging van groeifactoren, chemische verbindingen, virus-gemedieerde gen-levering, antisense oligonucleotiden en miRNAs. Verbindingen kunnen worden geleverd in de media of met de lokale micro-injecties van het weefsel in de 3D-cultuur kamer. Na 3 tot en met 7 dagen kweken het weefsel kan hetzij worden gehomogeniseerd celisolatie en FACS analyse of isolering van totaal RNA en eiwitten voor expressieprofiel analyse en verwerkt voor histologische analyse. De expressie status van vezelachtige proteïnen (αSMA, collageen type I en II, fibronectine), weefselarchitectuur van het gezwel deel van het snoer en de consistentie van het vezelachtige netwerk wordt beoordeeld vóór en na de behandelingen. Om de ECM herschikkingen volgen tijdens de kweek gecombineerde wij SHG (collageen) en twee-foton aangeslagen fluorescentie (elastine) beeldvorming.
De extracellulaire herschikkingen kan dan worden gekwantificeerd of gemodelleerd met behulp van afbeelding kwantificering software. Deze parameters geven een indicatie van de effecten van geneesmiddelen op fibrose of de Molecular wijzigingen die zijn veroorzaakt tijdens de cultuur. Bovendien ECM arrays kunnen ook worden uitgevoerd op enkele plakjes om een beter overzicht van de effecten te genereren. Algemeen hebben we een robuust systeem dat de studie van fibrose ex vivo toelaat vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben een octrooiaanvraag ingediend voor de ziekte van Dupuytren: 3D orgelcultuur. # GB1307200. Commerciële licentie en service contracten zijn beschikbaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
