मानव Dupuytren की<em> पूर्व vivo</em> Myofibroblasts के अध्ययन और बाह्य मैट्रिक्स बातचीत के लिए संस्कृति
Summary
Dupuytren रोग (डीडी) हाथ की हथेली के एक fibroproliferative बीमारी है। यहाँ, हम एक तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली में डीडी से संस्कृति लकीर नमूनों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के अल्पकालिक संस्कृति प्रणाली 3 डी संरचना के संरक्षण और fibrotic ऊतक की आणविक गुणों की अनुमति देता है।
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Dupuytren रोग (डीडी), एक सौम्य fibroproliferative बीमारी की वजह से हाथ की हथेली में पिंड और रस्सियों के गठन के लिए उंगलियों के स्थायी बल का कारण बनता है। बीमारी फैल उत्तरी यूरोप के कॉकेशियन के बीच विशेष रूप से उच्च है, रोग के अंतर्निहित आनुवंशिक एटियलजि एक अनजान बनी हुई है। डीडी की मुख्य विशेषता, tendons और हाथ और उंगलियों की हथेली की त्वचा के बीच अंतरिक्ष के कब्जे में एक कठिन रेशेदार ऊतक रूप है जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन (जैसे, मज्जा), से अधिक उत्पादन होता है स्थायी रूप से ठीक आंदोलनों में खलल न डालें हाथ दो, के 3। रोग की पुनरावृत्ति फाइब्रोसिस 1, 4 के एक कारण के रूप में अंतर्निहित आनुवंशिक परिवर्तन का पता चलता है। एक प्रभावी उपचार सीधे सेलुलर और आणविक स्तर पर बेकाबू तंतुमय तंत्र को लक्षित करने के लिए हो सकता है।
फाइब्रोसिस पर हमारा हाल ही में काम एक के विकास के लिए हमें प्रेरित किया हैऔषधि परीक्षण की क्षमता के साथ मानव तंतुमय ऊतक के अल्पकालिक संस्कृति की अनुमति देता है कि उपन्यास 3 डी संस्कृति प्रणाली। इस प्रणाली को 2 डी तंतुप्रसू संस्कृतियों के सीमित दृष्टिकोण से उबरने के लिए और फाइब्रोसिस 5 मध्यस्थता में TGFβ मार्ग सक्रियण की एक्सॉन लंघन द्वारा हासिल की आंशिक नीचे विनियमन के लिए एक भूमिका है, को परिभाषित करने में मदद मिली है।
हम डीडी रोगियों से पूर्व vivo मानव लकीर नमूनों myofibroblasts के बीच बातचीत और आसपास के ईसीएम 5, 6 अध्ययन करने के लिए संस्कृति के लिए एक विधि विकसित किया है। डीडी संयोजी ऊतक फाइब्रोसिस के अध्ययन के साथ-साथ अन्य तंतुमय रोगों शल्य excised की histopathological विश्लेषण पर निर्भर करता है नमूनों, ऊतक और प्राथमिक संस्कृतियों या सेल छँटाई प्रक्रियाओं की स्थापना से fibroblasts की अलगाव। वे प्रयोगकर्ता द्वारा रोग गुण या चिकित्सीय हस्तक्षेप के बहिर्जात हेरफेर की अनुमति नहीं देते क्योंकि इन तरीकों काफी स्थिर रहे हैं। इसके अलावा, प्राथमिक सीईडालूँगा संस्कृतियों संस्कृति परिस्थितियों के अनुकूल है और उनके जीन अभिव्यक्ति के गुण भी जल्दी अंश के दौरान, हर बीतने पर अनिवार्य रूप से इन विवो स्थिति से अलग करने के लिए करते हैं (बीतने 3 के बीच में और 6) 7, 8। हम में अपशिष्ट सर्जिकल सामग्री को बनाए रखने में कामयाब रहे हैं रोगी-विशिष्ट विशेषताओं के अध्ययन और विरोधी तंतुमय या विरोधी भड़काऊ दवा यौगिकों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है कि एक समय अवधि के लिए पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति।
प्रणाली डीडी fibroblasts के साथ ही अन्य प्रकार की कोशिकाओं 9 संवर्धन जब पहले मनाया के रूप में, लगाव पर ऊतक के परिवर्तन को रोकने के लिए, इस प्रकार, मध्यम के साथ नहीं, बल्कि प्लास्टिक के साथ ऊतक के संपर्क परमिट कि एक nitrocellulose झिल्ली पर आधारित है। डीडी ऊतक ही इन प्रोटीनों की बड़ी मात्रा में उत्पादन के बाद से कोई कोलेजन जेल या अन्य ईसीएम प्रोटीन सब्सट्रेट, आवश्यक है। यह देशी ईसीएम microenvironment और कारोबार पाप के रखरखाव के लिए फायदेमंद हैसीई मैट्रिक्स substrates के ऊतक वास्तुकला और समारोह 10, 11 के महत्वपूर्ण नियामक हैं। उदाहरण के लिए, ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin और कोलेजन के रूप में ईसीएम प्रोटीन, के रूप में इसी तरह उपकला कोशिकाओं 12 में शिखर-बेसल polarity के लिए दिखाया fibroblasts की सामने के पीछे ध्रुवता, 13 प्रभावित कर सकते हैं । फूट डालना कोशिकाओं सेल प्रवास और जीन अभिव्यक्ति, जैसे, झिल्ली पर α1β1 Integrin एक्सेसिबिलिटी मैं 14 कोलेजन टाइप करने के लिए कोशिका आसंजन को प्रभावित करता है जो निर्धारित करता है कोशिकी अणुओं की विषम वितरण किया है। इस 3 डी मॉडल के एक प्राथमिक लक्ष्य देशी microenvironment को बनाए रखने के लिए किया गया था के बाद से, कोई कृत्रिम ईसीएम मैट्रिक्स सब्सट्रेट इस्तेमाल किया गया था।
संक्षेप में: लकीर नमूनों समान रूप से एक बाँझ वातावरण में कटौती कर रहे हैं और nitrocellular झिल्ली पर रखा। इंजेक्शन के माध्यम से administrated उपचार की आवश्यकता है, तो वे झिल्ली पर रखा गया है के बाद ऊतकों इंजेक्ट कर रहे हैं। उपचार inj के माध्यम से प्रशासित किया जा करने की आवश्यकता नहीं हैection तो यौगिक (1% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाता है। पहले से 5 के रूप में वर्णित संस्कृतियों, 30% sucrose के समाधान के माध्यम से संसाधित ऊतक 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय हो गई है, जिसके बाद दस दिनों की एक अधिकतम, अक्टूबर परिसर में एम्बेडेड और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के लिए रखा जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व vivo मानव संयोजी ऊतक संवर्धन के सबसे महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए शल्य हटाने के बाद ऊतक का तत्काल उपयोग कर रहे हैं; ऊतक सभी समय पर मध्यम या नमकीन घोल में रहना चाहिए; एक बाँझ सं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
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