High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Både transkriptionel og post-transkriptionel regulering har en dybtgående indvirkning på gener udtryk. Men almindeligt vedtagne cellebaserede screeningassays fokus på transkriptionel regulering, der hovedsagelig tager sigte på at identificere promoter-targeting molekyler. Som et resultat, er post-transkriptionelle mekanismer vid udstrækning udækket af genekspression udvikling målrettet lægemiddel. Her beskriver vi en celle-baseret assay der tager sigte på at undersøge betydningen af den 3 'utranslaterede region (3'UTR) i moduleringen af den skæbne dets mRNA og ved identifikation af forbindelser i stand til at ændre den. Assayet er baseret på anvendelsen af et luciferase reporter konstrukt indeholdende 3'UTR af et gen af interesse er stabilt integreret i en sygdom-relevant cellelinie. Protokollen er opdelt i to dele, med det oprindelige fokus på den primære screening rettet mod at identificere molekyler, der påvirker luciferaseaktivitet efter 24 timers behandling. Den anden del af protokollenbeskriver counter-screening nødvendigt at skelne forbindelser modulerende luciferaseaktivitet specifikt gennem 3'UTR. Ud over den detaljerede protokol og repræsentative resultater, vi leverer vigtige overvejelser om analysen udvikling og validering af hittet (r) på den endogene målet. Den beskrevne cellebaserede reportergen assay vil give forskerne at identificere molekyler, der modulerer proteinniveauer via post-transkriptionelle mekanismer er afhængige af en 3 'UTR.
Introduction
I en lang periode transkriptionel regulering af genekspression blev anset for at spille en vigtig, hvis ikke udelukkende rolle i kontrollen proteinproduktion. Akkumulerende beviser, viser imidlertid, at posttranskriptionel regulering bidrager så meget som, hvis ikke mere end, transkriptionsregulering at bestemme cellulær protein overflod 1,2. Post-transkriptionel kontrol af genekspression er meget mere kompleks og omfattende, end det var ved første tanke. Faktisk har alle de forskellige stadier af post-transkriptionel kontrol opstået for at blive reguleret, herunder mRNA behandling, lokalisering, omsætning, oversættelse 3 samt den nyligt beskrevne reversible RNA methylering 4. Fra en række post-transkriptionel regulering processer potentielt berørte beskrevet assayet nedenfor fokuserer på dem, der involverer mRNA 3 'utranslaterede region (3'UTR). 3'UTR bredt påvirker mRNA skæbne hovedsageligt via specifik interaktion af RNA-bindende proteins og ikke-kodende RNA sine regulatoriske sekvenser og / eller sekundære strukturer 5. Derfor vil små molekyler der ændrer disse vekselvirkninger eller interfererer med opstrøms signaltransduktionsveje ændre balancen, der regulerer protein overflod. Denne terapeutiske tilgang er af særlig betydning for menneskelige sygdomme, som vides viser, at sygdomsrelaterede relevante gener underkastes posttransskriptionel regulering, som således udgør et potentielt mål for farmakologisk intervention. Derfor kan der muliggør screening af mRNA-niveauer 'modulatorer gennem indgreb i posttranskriptionel kontrolmekanismer i en high-throughput format blive værdifulde redskaber i identifikation af potentielle nye behandlinger.
Den beskrevne cellebaserede reportergen assay muliggør identifikation af forbindelser, der kan modulere mRNA skæbne via mekanismer afhængig af 3'UTR. Den består af flere hovedstol components (figur 1) og kræver få indledende skridt til at validere gennemførligheden af analysen. Først og fremmest er det reporter konstrukt designet til at omfatte 3'-UTR fra et gen af interesse. 3'UTR er fusioneret til enden af et reportergen, såsom ildflue-luciferase (figur 1). Eventuelle ændringer i post-transkriptionelle kontrolmekanismer udøves gennem den indsatte 3'UTR vil ændre stabiliteten og / eller translation effektiviteten af dette kimære transskript, hvilket resulterer i forskellige luciferase niveauer. Derfor ændringer i luciferaseaktivitet tjener som indirekte mål for påvirkede post-transkriptionel regulering af genet af interesse. Den anden komponent i systemet er en kontrol reporter konstrukt, en identisk ekspressionsplasmid, der udtrykker den samme reportergen, men indeholder ikke nogen 3'UTR. De to reporterplasmider kan udformes i laboratoriet under anvendelse af konventionelle molekylærbiologiske protokoller eller købt fra kommercielle kilder.
Udvælgelsen af en passende cellelinie er kritisk for assay konstruktion. Hvilken cellelinie er den optimale model afhænger af mange faktorer, der spænder fra de kliniske krav som maksimal lighed med patologi til blot praktiske spørgsmål som tilgængelighed, transficerbarhed og vækst karakteristika. Vigtigt er det, før at fortsætte en bør sørge for, at fusion af 3'UTR til reportergenet har en forventet effekt på størrelsen af det kimære udskrift. Fraværet af signifikant forskel i luciferase signal fra 3'UTR-bærende og kontrol reporterkonstruktioner kortvarigt transficeret i de markerede celler tyder på, at 3'UTR er ikke funktionel i denne cellulære model, hvilket fik til søgning af alternative dem. For high-throughput format, bør 3'UTR-bærende og kontrol luciferasereporter konstruktioner integreres stabilt i den valgte cellelinje. Ved hjælp af en stabilt integreret over transient transficeretcellelinje er at foretrække af flere årsager. Dette vil udvide valget af en cellulær model herunder svære at transfektere cellelinjer, mindske variabiliteten i de data, der følger af udsving i transfektionseffektivitet, stilne omkostningerne. Endvidere er der ved forbigående transfektion celler er meget ofte overbelastet med et DNA-plasmid fører til mætning af systemet. I disse indstillinger en yderligere stigning i reporter udtryk kan være udfordrende, hvilket resulterer i nedsat følsomhed over for potentielle opregulering forbindelser.
Endelig, når alle assaykomponenterne er sat op, er det afgørende før flytning til high-throughput format for at bestemme gennemførligheden af assayet, dvs hvis luciferaseaktivitet faktisk kan op- og ned-reguleres specifikt via indsat 3 ' UTR. De bedste kontrol vil være små molekyler rapporteret at modulere stabilitet eller oversættelighed af mRNA gennem 3'UTR af interesse. Hvis der disse erikke er muligt, er surrogat kontrol efterligne den ønskede effekt accepteret. Det kan være miRNA eller RNA-bindende proteiner, der vides at udøve deres virkninger via binding til 3'-UTR af interesse. Evaluering af sådanne kontroller før det primære screening indikerer ikke kun funktionaliteten af den udviklede assay, men giver også mulighed for estimering af sin dynamikområde, følsomhed og ydeevne i høj kapacitet format.
Ved hjælp af beskrevne protokol screenede vi et 2.000 forbindelse bibliotek 6. Neuroblastom, den mest almindelige ekstrakranialt fast tumor hos børn, blev anvendt som en biologisk model og 3'UTR af MitCN onkogenet, hvis amplifikation stærkt forudsiger negative resultat af neuroblastom, som et målgen 7. Figur 2 skitserer den eksperimentelle layout. Screeningen blev delt i tre kørsler med batchstørrelsen af 27 plader screenet i én køre. Portionen af 27 plader inkluderet Spectrum Collection bibliotekplader N.1-N.8 + N.25 (første kørsel), n.9-n.16 + N.25 (anden kørsel) og n.16-n.24 + N.25 (tredje løb), hver plade screenet i tre eksemplarer. Således blev et bibliotek plade (N.25) analyseres inden for alle tre kørsler, der muliggør indbyrdes run sammenligning. Protokollen nedenfor beskriver en enkelt kørsel af 9 Library plader testet tredobbelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
