転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
転写および転写後調節の両方が遺伝子発現に大きな影響を持っている。しかし、一般的に採用細胞ベースのスクリーニングアッセイは、本質的に、プロモーター – 標的分子の同定を目的とされて、転写調節に焦点を当てる。その結果、転写後のメカニズムは、主に薬剤開発の標的遺伝子の発現によって明らかにされる。ここでは、それを修正することができる化合物を同定することで、そのmRNAの運命の調節において3 '非翻訳領域（UTR）の役割を調べることを目的とした細胞ベースのアッセイを記載する。アッセイは、安定に疾患関連細胞株に組み込まれた目的の遺伝子の3 'UTRを含むルシフェラーゼレポーター構築物の使用に基づいている。プロトコルは、処理の24時間後にルシフェラーゼ活性に影響する分子の同定を目的とした一次スクリーニングでの最初の焦点を、2つの部分に分割される。プロトコルの第2部分カウンタースクリーニング3 'UTRを通じて、具体的ルシフェラーゼ活性を調節する化合物を区別する必要を説明しています。詳細なプロトコルおよび代表的な結果に加えて、我々はアッセイ開発および内因性標的に対するヒット（複数可）の妥当性についての重要な考慮事項を提供する。記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、科学者が3 'UTR依存的転写後機構を介してタンパク質レベルを調節する分子を同定することを可能にする。
Introduction
長期間の遺伝子発現の転写調節は、タンパク質産生の制御において主要でない場合、排他的な役割を果たしていると考えられた。証拠を蓄積するが、転写後調節は、細胞のタンパク質存在量1,2を決定する限り、そうでない場合、転写調節よりも寄与していることを示している。遺伝子発現の転写後制御は、最初に考えただけであったよりはるかに複雑かつ精巧である。実際には、転写後制御のすべての様々な段階は、mRNAプロセシング、局在、代謝回転、並進3と同様に、新たに記載の可逆的RNAのメチル4を含む、調節されることが浮上している。潜在的に影響を受けた転写後調節プロセスの数から、以下に記載のアッセイは、mRNAの3 '非翻訳領域（UTR）に関与するものに焦点を当てている。 3 'UTRは広く、主にRNA結合PRの特異的相互作用を介してmRNAの運命に影響を与えるその調節配列および/ または二次構造5 oteinsおよび非コードRNA。したがって、これらの相互作用を変化させるか、上流のシグナル伝達経路を妨害する小分子は、タンパク質の存在量を調節するバランスをシフトする。この治療アプローチは、証拠は、疾患関連遺伝子がこのような薬理学的介入のための潜在的標的を表す転写後調節に供されていることを示す存在するヒトの病状のために特に重要である。したがって、ハイスループット形式における転写後制御機構との干渉を介してmRNAレベル「モジュレーターのスクリーニングを可能にするシステムは、潜在的な新規治療の同定に有用なツールになることができる。
記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、その3 'UTR依存メカニズムを介してmRNAの運命を調節することができる化合物の同定を可能にする。これは、いくつかの主要なCで構成されていomponents（ 図1）およびアッセイの実現可能性を検証するためにいくつかの予備的な手順が必要です。まず、レポーター構築物は、目的の遺伝子の3 'UTRを含むように設計されている。 3 'UTRは、ホタルルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子（ 図1）の末端に融合される。挿入された3 'UTRを介して発揮される転写後制御機構の変化は、様々なルシフェラーゼのレベルをもたらす、このキメラ転写物の安定性および/または翻訳効率を変える。したがって、ルシフェラーゼ活性の変化は、目的の遺伝子の影響を受けた転写後調節の間接的な尺度として役立つ。システムの第二の成分は、対照レポーター構築、同じレポーター遺伝子を発現するが、任意の3 'UTRを含まない同一の発現プラスミドである。 2つのレポータープラスミドは、従来の分子生物学プロトコールを用いて実験室で設計された、または商業的供給源から購入することができる。
適切な細胞株の選択は、アッセイの構築のために重要である。どの細胞株が最適モデルである可用性、トランスフェクション能力、及び成長特性のようなだけで実用的な問題への病理に対する最大の類似性のような臨床要件に至るまで、多くの要因に依存します。重要なことは、前には1つが、レポーター遺伝子の3 'UTRの融合がキメラ転写物のレベルで期待される効果があることを確認する必要が進みます。 3からのルシフェラーゼシグナルの有意差がないこと」UTR-ベアリングとコントロールレポーター一過選択した細胞にトランス構築物3ことを示すことになる」UTRは、代替ものの検索の入力を求める、この細胞モデルにおいて機能していません。ハイスループットフォーマットでは、3 'UTR-軸受および制御ルシフェラーゼレポーター構築物を安定的に選択された細胞株中で統合されるべきである。安定的にトランスフェクト一過上に統合を使用して、細胞株は、いくつかの理由のために好ましい。これは、困難なトランスフェクト細胞株を含む細胞モデルの選択を広げるトランスフェクション効率の変動によるデータのばらつきを減少させ、コストが治まる。また、一過性トランスフェクション細胞に非常に多くの場合、システムの飽和につながるDNAプラスミドで過負荷にされている。これらの設定ではレポーター発現の更なる増加は、潜在的なアップレギュレート化合物に向かって減少した感度で、その結果、困難な場合があります。
すべてのアッセイ成分が設定されている場合、ルシフェラーゼ活性を特異的に挿入3を介して上方及び下方調節することができ、実際に最後に、もし、それは、 すなわち 、アッセイの実行可能性を決定するために、ハイスループットフォーマットに移動する前に、重要であるUTR。最高のコントロールが関心の3 'UTRを通じてmRNAの安定性または翻訳可能を調節することが報告された小分子であろう。これらを有するある場合所望の効果を模倣していない可能性、サロゲートコントロールが受け入れられます。これらのmiRNAまたは対象の3 'UTRへの結合を介してそれらの効果を発揮することが知られているRNA結合タンパク質であり得る。このような制御の評価は次スクリーニングは、開発されたアッセイの機能性を示すだけでなく、ハイスループット形式でのダイナミックレンジ、感度や性能の推定を可能にするだけでなく、前に。
記載されているプロトコルを使用して、我々は、2000-化合物ライブラリ6をスクリーニングした。神経芽細胞腫、幼児期の最も一般的な頭蓋外固形腫瘍は、増幅強く標的遺伝子7として、神経芽細胞腫の有害転帰を予測するMYCN癌遺伝子の生物学的モデルおよび3 'UTRとした。 図2実験的なレイアウトの概要を示します。スクリーニングは、1回の実行でスクリーニング27のプレートのバッチサイズで3回の実行に分けた。 27プレートのバッチはスペクトラムコレクションライブラリが含まれてプレートN.1-N.8 + n.25（ファーストラン）、n.9-n.16 + n.25（セカンドラン）とn.16-n.24 + n.25（第3ラン）、各三重でスクリーニングプレート。このように、1ライブラリプレート（n.25）が可能インターラン比較を行う3つのすべての実行中で分析した。以下のプロトコルを3回試験9ライブラリプレートの回の実行について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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