Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Les deux régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle ont un impact profond sur l'expression des gènes. Cependant, des essais de criblage à base de cellules couramment adoptées se concentrent sur la régulation transcriptionnelle, étant essentiellement destinées à l'identification de molécules de promoteur-ciblage. En conséquence, des mécanismes post-transcriptionnels sont en grande partie non couvert par l'expression du gène cible de développement de médicaments. Nous décrivons ici un essai à base de cellules visant à étudier le rôle de «région non traduite (3 'UTR 3) dans la modulation du sort de son ARNm, et à identifier des composés capables de le modifier. Le dosage est basé sur l'utilisation d'une construction de rapporteur luciférase contenant la 3 'UTR d'un gène d'intérêt intégré de façon stable dans une lignée cellulaire maladie pertinent. Le protocole est divisé en deux parties, avec l'accent initial sur le dépistage primaire visant à l'identification de molécules affectant l'activité de la luciférase après 24 h de traitement. La seconde partie du protocoledécrit la contre-criblage nécessaire de discriminer composés modulant l'activité de luciférase en particulier par la UTR 3 '. En plus du protocole détaillé et des résultats représentatifs, nous fournissons des considérations importantes sur le développement de l'essai et la validation du tube (s) sur la cible endogène. Le dosage du gène rapporteur décrit à base de cellules permettra aux scientifiques d'identifier des molécules modulant les taux de protéines par des mécanismes post-transcriptionnel dépendant d'un 'UTR 3.
Introduction
Pendant une longue période régulation transcriptionnelle de l'expression génique a été pensé pour jouer un rôle majeur si ce ne est le rôle exclusif dans le contrôle de la production de protéines. L'accumulation de preuves, cependant, indique que régulation post-transcriptionnelle contribue autant, sinon plus, que, la régulation transcriptionnelle de déterminer protéine cellulaire abondance 1,2. Contrôle post-transcriptionnelle de l'expression génique est beaucoup plus complexe et élaborée que fut d'abord pensée. En fait, toutes les différentes étapes de contrôle post-transcriptionnel ont émergé pour être réglementés, y compris le traitement de l'ARNm, la localisation, le chiffre d'affaires, la traduction 3 ainsi que l'ARN réversible méthylation 4 nouvellement décrit. De nombreux processus de régulation post-transcriptionnels potentiellement affectés, le dosage décrit ci-dessous se concentre sur celles impliquant 'non traduite (3' UTR de l'ARNm 3). 3 'UTR affecte globalement ARNm sort principalement par interaction spécifique de pr liaison à l'ARNoteins et ARN non-codants à ses séquences régulatrices et / ou structures secondaires 5. Par conséquent, de petites molécules qui modifient ces interactions ou interfèrent avec en amont des voies de transduction du signal se déplacera l'équilibre qui régit abondance des protéines. Cette approche thérapeutique est d'une importance particulière pour les pathologies humaines pour lesquelles la preuve existe montrant que des gènes de maladies pertinents sont soumis à régulation post-transcriptionnelle, qui représente ainsi une cible potentielle pour une intervention pharmacologique. Par conséquent, les systèmes permettant le dépistage des modulateurs de niveaux d'ARNm par interférence avec les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel dans un format à haut débit peuvent devenir des outils précieux dans l'identification de nouveaux traitements potentiels.
Le dosage de gène rapporteur à base de cellules décrit permet l'identification de composés capables de moduler l'ARNm sort par des mécanismes dépendant de son extrémité 3 'UTR. Il se compose de plusieurs c principaleomposantes (Figure 1) et nécessite quelques étapes préliminaires pour valider la faisabilité de l'essai. Tout d'abord, la construction de rapporteur est conçu pour inclure l'UTR en 3 'd'un gène d'intérêt. La 3 'UTR est fusionnée à l'extrémité d'un gène rapporteur tel que la luciférase de luciole (figure 1). Tout changement dans les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercées par la inséré 3 'UTR vont modifier la stabilité et / ou l'efficacité de traduction de ce transcrit chimérique, résultant en des niveaux de luciférase variés. Par conséquent, des changements dans l'activité de luciférase servent comme mesure indirecte de la régulation post-transcriptionnelle affectée du gène d'intérêt. Le deuxième composant du système est une construction rapporteur témoin, un plasmide d'expression qui exprime identique le même gène rapporteur, mais ne contient pas de 3 'UTR. Les deux plasmides rapporteurs peuvent être conçus dans le laboratoire en utilisant les protocoles classiques de biologie moléculaire ou achetés auprès de sources commerciales.
La sélection d'une lignée cellulaire appropriée est essentielle pour la construction de dosage. Quelle ligne de cellule est le modèle optimal dépend de nombreux facteurs, allant des exigences cliniques comme ressemblance maximale à la pathologie à des questions pratiques comme juste caractéristiques disponibilité, transfectabilité, et de croissance. Il est important, avant de procéder il faut se assurer que la fusion des 3 'UTR du gène rapporteur a un effet attendu sur le niveau de la transcription chimérique. L'absence de différence significative dans le signal de la luciférase à partir de la 3 'UTR-palier et le contrôle constructions rapporteurs transfecté de manière transitoire dans les cellules sélectionnées indiquerait que la 3' UTR ne est pas fonctionnelle dans ce modèle cellulaire, ce qui incite à rechercher d'autres possibles. Pour le format à haut débit, les 3 'UTR-porteurs et de contrôle luciférase constructions rapporteurs devraient être intégrés de manière stable dans la lignée cellulaire choisie. Utilisation d'un intégré de manière stable sur transitoirement transfectéeslignée cellulaire est préférable pour plusieurs raisons. Cela élargira le choix d'un modèle cellulaire incluant des lignées cellulaires difficiles à transfecter, diminuer la variabilité dans les données découlant des fluctuations de l'efficacité de transfection, calmer les coûts. En outre, sur les cellules de transfection transitoire sont très souvent surchargé avec un plasmide d'ADN qui conduit à la saturation du système. Dans ces paramètres une nouvelle augmentation de l'expression de journaliste peut être difficile, entraînant une diminution de sensibilité à l'égard des composés de régulation positive potentiels.
Enfin, lorsque tous les composants d'analyse sont mis en place, il est essentiel avant de passer au format à haut débit afin de déterminer la faisabilité de l'essai, ce est à dire, si l'activité luciférase peut être fait en amont et en réglementation spécifique via le inséré 3 ' UTR. Les meilleurs contrôles seraient rapportés de petites molécules pour moduler la stabilité de l'ARNm ou traduisibilité par UTR en 3 'd'intérêt. Si ceux-ci est ayantpas possible, les contrôles de substitution imitant l'effet désiré sont acceptées. Il peut se agir miARN ou des protéines liant l'ARN connus pour exercer leurs effets en se liant à la 3 'UTR de l'intérêt. L'évaluation de ces contrôles avant la projection primaire indique non seulement la fonctionnalité de l'essai développé, mais permet également à l'estimation de sa gamme dynamique, la sensibilité et la performance dans le format à haut débit.
En utilisant le protocole décrit nous avons criblé une bibliothèque composé 6-2000. Neuroblastome, la tumeur solide extra plus courante de l'enfance, a été utilisé comme un modèle biologique et 3 'UTR de l'oncogène MYCN, dont l'amplification prédit fortement issue défavorable du neuroblastome, comme un gène cible 7. La figure 2 présente les dispositif expérimental. La projection a été divisée en trois courses avec la taille du lot de 27 plaques projetés en une seule fois. Le lot de 27 plaques inclus bibliothèque Spectrum Collectionplaques n.1-n.8 + n.25 (première manche), n.9-n.16 + n.25 (deuxième manche) et n.16-n.24 + n.25 (troisième terme), chaque plaque projeté en trois exemplaires. Ainsi, une plaque de la bibliothèque (n.25) a été dosé dans les trois courses rendant possible la comparaison inter-terme. Le protocole ci-dessous décrit une seule série de neuf plaques de bibliothèque testés en triple exemplaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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