Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Ambos transcrição e regulação pós-transcricional ter um impacto profundo sobre a expressão dos genes. No entanto, comumente adotadas testes de rastreio baseados em células se concentrar em regulação da transcrição, sendo essencialmente por objectivo a identificação de moléculas-alvo do promotor. Como um resultado, os mecanismos de pós-transcrição são em grande parte a descoberto pela expressão de genes de desenvolvimento de drogas específicas. Descrevemos aqui um ensaio de base celular com o objectivo de investigar o papel da "região não traduzida (3 'UTR a 3) na modulação do destino do seu mRNA, e a identificação de compostos capazes de modificar. O ensaio baseia-se no uso de uma construção repórter da luciferase contendo a UTR 3 'de um gene de interesse integrado de forma estável numa linha celular relevante doença. O protocolo é dividido em duas partes, com o foco inicial no rastreio primário destinado à identificação de moléculas que afectam a actividade de luciferase depois de 24 horas de tratamento. A segunda parte do protocolodescreve o contra-rastreio necessário para discriminar compostos que modulam especificamente a actividade da luciferase por meio da UTR 3 '. Em adição ao protocolo detalhado e os resultados representativos, nós fornecemos considerações importantes sobre o desenvolvimento do ensaio e a validação da batida (s) sobre o alvo endógeno. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito vai permitir que os cientistas para identificar moléculas que modulam os níveis de proteína através de mecanismos de pós-transcrição dependentes de uma UTR 3 '.
Introduction
Durante um longo período de regulação de transcrição da expressão do gene foi pensada para desempenhar um importante papel, se não exclusiva no controlo da produção de proteína. Um acúmulo de evidências, no entanto, indica que a regulação pós-transcricional contribui tanto quanto, se não mais do que, a regulação da transcrição para determinar a abundância de proteína celular 1,2. Controle pós-transcricional da expressão do gene é muito mais complexo e elaborado do que se pensava anteriormente. Na verdade, todas as diversas fases de controle pós-transcricional surgiram para ser regulamentada, incluindo processamento de mRNA, localização, volume de negócios, a tradução 3, bem como o recém-descrita RNA metilação reversível 4. A partir de um número de processos de regulação pós-transcricional potencialmente afectados, o ensaio descrito a seguir concentra-se sobre aquelas envolvendo "região não traduzida (3 'UTR do mRNA 3). 3 'UTR amplamente afeta destino mRNA, principalmente, via interação específica de ligação RNA-proteins e RNAs não-codificantes para as suas sequências reguladoras e / ou estruturas secundárias 5. Portanto, pequenas moléculas que alteram essas interações ou interferir com a montante vias de transdução de sinal vai mudar o equilíbrio que regula a abundância de proteínas. Esta abordagem terapêutica é de particular importância para patologias humanas em que existem evidências mostrando que os genes relevantes a doença estão sujeitos a regulação pós-transcricional, o qual representa, assim, um alvo potencial para a intervenção farmacológica. Portanto, os sistemas que permitam a triagem de moduladores níveis de mRNA 'através da interferência com os mecanismos de controle pós-transcricional em um formato de alto rendimento podem se tornar ferramentas valiosas na identificação de potenciais tratamentos novos.
O ensaio do gene repórter baseado em células descrito permite a identificação de compostos capazes de modular destino ARNm através de mecanismos dependentes da sua extremidade 3 'UTR. Consiste em várias diretor componentes (Figura 1) e requer poucos passos preliminares para validar a viabilidade do ensaio. Em primeiro lugar, a construção do repórter é concebido de modo a incluir a UTR 3 'de um gene de interesse. A UTR 3 'é fundido com a extremidade de um gene repórter, tal como luciferase de pirilampo (figura 1). Quaisquer alterações nos mecanismos de controle pós-transcricional exercidas através da inserida UTR 3 'irá alterar a estabilidade e / ou a eficiência da tradução desta transcrição quimérico, resultando em níveis de luciferase variadas. Portanto, mudanças na atividade luciferase servir como medida indireta de regulação pós-transcricional afetada do gene de interesse. O segundo componente do sistema é uma construção repórter de controlo, um plasmídeo de expressão idênticos que expressa o mesmo gene repórter, mas não contém qualquer UTR 3 '. Os dois plasmídeos repórter pode ser concebido no laboratório utilizando protocolos de biologia molecular convencionais ou adquiridos de fontes comerciais.
A selecção de uma linha celular apropriada é essencial para a construção de ensaio. Qual linha celular é o modelo ideal depende de inúmeros fatores que vão desde a necessidade clínica, como semelhança máxima de patologia para questões apenas práticos como características disponibilidade, transfectabilidade, e de crescimento. É importante notar que antes de proceder se deve certificar-se de que a fusão da UTR 3 'para o gene repórter tem um efeito esperado sobre o nível de transcrição quimérico. A ausência de diferença significativa no sinal da luciferase a partir do 3 'UTR de suporte e controlo repórter construções transfectadas transientemente em células seleccionadas que indicaria que a UTR 3' não é funcional neste modelo celular, o que levou para a pesquisa de outros alternativos. Para o formato de alto rendimento, os UTR 3 'de suporte de controlo e de luciferase construções repórter deve ser integrado de forma estável na linha de células seleccionada. Usando um integrado de forma estável ao longo transfectadas transitoriamenteA linha celular é preferível por várias razões. Isso vai ampliar a escolha de um modelo de celular, incluindo linhas de células difíceis de transfecção, diminuir a variabilidade dos dados decorrentes de oscilações de eficiência de transfecção, diminuir os custos. Além disso, após a transfecção as células transientes são frequentemente muito sobrecarregada com um plasmídeo de ADN que conduz à saturação do sistema. Nestas configurações de um novo aumento na expressão repórter pode ser um desafio, resultando em diminuição da sensibilidade em relação a compostos upregulating potenciais.
Finalmente, quando todos os componentes do ensaio são criados, é fundamental antes de se mudar para o formato de alto rendimento para determinar a viabilidade do ensaio, ou seja, se a atividade luciferase pode ser de fato para cima e para baixo-regulado especificamente através da inserido 3 ' UTR. Os melhores controlos seria pequenas moléculas relatados para modular a estabilidade do mRNA ou traductibilidade através da UTR 3 'de interesse. Se tendo estes énão é possível, são aceitos controles substitutos imitando o efeito desejado. Estes poderiam ser miARNs ou proteínas de ligação a ARN conhecidos para exercer os seus efeitos através de ligação a UTR 3 'de interesse. Avaliação de tais controlos antes da despistagem primária não só indica a funcionalidade do ensaio desenvolvido, mas também permite uma estimativa da sua gama dinâmica, sensibilidade e desempenho no formato de alto rendimento.
Usando o protocolo descrito nós analisamos uma biblioteca de 2.000 composto 6. Neuroblastoma, o tumor sólido extracraniano mais comum da infância, foi usada como modelo biológico e a 3 'UTR do oncogene MYCN, cuja amplificação prediz fortemente resultado adverso de neuroblastoma, como um gene alvo 7. A Figura 2 descreve o esquema experimental. A triagem foi dividida em três corridas com o tamanho do lote de 27 placas teladas em uma corrida. O lote de 27 placas incluído biblioteca Coleção Spectrumplacas n.1-n.8 + n.25 (primeira corrida), n.9-n.16 + n.25 (segunda corrida) e n.16-n.24 + n.25 (terceira pista), cada placa exibido em triplicado. Assim, uma placa de biblioteca (n.25) foi testada em todas as três corridas possibilitando comparação inter-run. O protocolo a seguir descreve uma única corrida de 9 placas de biblioteca testados em triplicado.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
