הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
תעתיק ורגולציה לאחר תעתיק לשניהם יש השפעה עמוקה על ביטוי גנים. עם זאת, מבחני סינון מבוסס תאים נפוצים אימצו להתמקד ברגולצית תעתיק, שנועדו במהותו בזיהוי של מולקולות מיקוד אמרגן. כתוצאה מכך, מנגנונים שלאחר תעתיק נחשפים במידה רבה על ידי פיתוח תרופות ממוקדות ביטוי גנים. כאן אנו מתארים assay מבוסס תאים שנועד לבחון את התפקיד של 'האזור מתורגם (3' 3 UTR) באפנון של הגורל של mRNA שלה, ובזיהוי תרכובות יוכלו לשנות אותה. Assay מבוסס על השימוש במבנה כתב בלוציפראז המכיל 'UTR 3 של גן של עניין המשולב ביציבות לקו תא מחלה-רלוונטית. הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, עם ההתמקדות הראשונית על ההקרנה הראשונית שמטרתו זיהוי של מולקולות המשפיעות על הפעילות בלוציפראז לאחר 24 שעות של טיפול. החלק השני של הפרוטוקולמתאר את הצורך להפלות תרכובות ויסות פעילות לוציפראז במיוחד דרך UTR '3 הקרנה ללא מרשם. בנוסף לפרוטוקול מפורט ותוצאות נציג, אנו מספקים שיקולים חשובים על פיתוח assay והאימות של הלהיט (ים) על יעד אנדוגני. Assay הגן המתואר מבוסס תאי הכתב יאפשר למדענים לזהות מולקולות ויסות רמות חלבון באמצעות מנגנונים שלאחר תעתיק תלויים ב'UTR 3.
Introduction
לרגולצית תעתיק תקופה ארוכה של ביטוי גנים שחשבו לשחק עיקרי אם לא בלעדי תפקיד בשליטה על ייצור חלבון. צבירת ראיות, לעומת זאת, מצביע על כך שרגולציה לאחר תעתיק תורמת באותה מידה, אם לא יותר מ, רגולציה תעתיק לקבוע שפע חלבון תאי 1,2. שליטה לאחר תעתיק של ביטוי גנים היא הרבה יותר מורכב ומשוכלל יותר מהייתה במחשבה ראשונה. למעשה, את כל השלבים השונים של בקרה לאחר תעתיק צמחו להיות מוסדרים, כוללים עיבוד mRNA, לוקליזציה, מחזור, תרגום 3, כמו גם מתילציה RNA הפיכה תיארה זה עתה 4. ממספר תהליכי רגולציה לאחר תעתיק מושפע באופן פוטנציאלי, assay מתואר להלן מתמקד באלה הקשורים 'האזור מתורגם (3' mRNA 3 UTR). 3 'UTR רחב משפיע גורל mRNA בעיקר באמצעות אינטראקציה ספציפית של יחסי ציבור מחייב RNAoteins וRNAs ללא קידוד רצפיה רגולציה ו / או מבנים משניים 5. לכן, מולקולות קטנות המשנות אינטראקציות אלה או להפריע למסלולי העברת אותות במעלה הזרם תעבור את האיזון שמסדיר שפע חלבון. גישה טיפולית זו היא בעלת חשיבות מיוחדת לפתולוגיות אדם שלראיות מראים כי קיימות גנים של מחלות-רלוונטי נתונות לרגולציה שלאחר תעתיק, אשר מייצגת אפוא יעד פוטנציאלי להתערבות תרופתית. לכן, מערכות המאפשרות להקרנה של מאפננים 'רמות ה- mRNA באמצעות התערבות במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק בפורמט תפוקה גבוהה יכולות להיות כלי רב ערך בזיהוי של טיפולי רומן פוטנציאליים.
Assay גן הכתב מבוסס התאים המתוארים מאפשר לזיהוי תרכובות מסוגלת לווסת את גורל mRNA באמצעות מנגנונים תלויים בה 3 'UTR. הוא מורכב מכמה ג העיקריomponents (איור 1) ודורש כמה צעדים ראשוניים כדי לאמת את הכדאיות של assay. קודם כל, לבנות הכתב נועד כולל UTR '3 מגן של עניין. 3 'UTR הוא התמזגו בסופו של גן כתב כגון לוציפראז גחלילית (איור 1). כל שינוי במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעל באמצעות 3 'UTR הוכנס ישנה את היציבות ו / או יעילות תרגום של תמליל chimeric זה, וכתוצאה מכך רמות לוציפראז מגוונות. לכן, שינויים בפעילות לוציפראז לשמש אמצעי עקיף של תקנה לאחר תעתיק המושפע של הגן של עניין. המרכיב השני של המערכת הוא לבנות כתב שליטה, פלסמיד ביטוי זהה המבטא את אותו גן הכתב אך אינו מכיל 'UTR 3. יכולים להיות מתוכנן שני פלסמידים הכתב במעבדה תוך שימוש בפרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים או שנרכשו ממקורות מסחריים.
הבחירה של קו תא מתאים היא קריטית לבניית assay. איזה קו התא הוא המודל האופטימלי תלוי בגורמים רבים, החל מדרישות קליניות כמו דמיון מקסימאלי לפתולוגיה לסוגיות מעשיות רק כמו מאפיינים זמינות, transfectability, וצמיחה. חשוב לציין, לפני להמשיך יש לוודא כי שילוב של 3 'UTR לגן הכתב יש השפעה צפויה על הרמה של תמליל chimeric. היעדר ההבדל משמעותי באות בלוציפראז מן 3 'UTR כתב נושאות ושליטה בונת transfected זמני בתאים שנבחרו היה מציין כי 3' UTR הוא לא פונקציונלי במודל סלולארי זה, מה שגרם לחיפוש של חלופה אלה. לפורמט התפוקה הגבוהה, בונה כתב 3 נושאות UTR 'ולוציפראז השליטה צריכה להיות משולבת ביציבות בקו התא הנבחר. שימוש משולב על יציבות זמנית transfectedשורת תאים עדיפה מכמה סיבות. זה ירחיב את הבחירה של מודל סלולארי כולל שורות תאים שקשה transfect, להקטין את השונות בנתונים נובעים מתנודות ביעילות transfection, חולף עלויות. יתר על כן, על תאי transfection חולפים הם לעתים קרובות מאוד עמוסים עם פלסמיד דנ"א המוביל לרוויה של המערכת. בהגדרות אלה עלייה נוספת בביטוי העיתונאי עשויה להיות מאתגרת, וכתוצאה מכך ירידה ברגישות כלפי תרכובות upregulating פוטנציאליות.
לבסוף, כאשר כל רכיבי assay מוגדרים, זה קריטי, לפני שעבר לפורמט התפוקה הגבוהה כדי לקבוע את הכדאיות של assay, כלומר, אם פעילות לוציפראז יכול להיות אכן למעלה ובמיוחד באמצעות הוכנס 3 'למטה מוסדר UTR. הפקדים הטובים ביותר יהיו מולקולות קטנות דיווחו לווסת את היציבות או translatability של mRNA באמצעות UTR '3 של עניין. אם יש אלה הואלא ניתן, בקרות פונדקאיות מחקה את האפקט הרצוי מתקבלות. אלה יכולים להיות miRNAs או מחייב חלבוני RNA הידועים להפעיל האפקטים שלהם באמצעות קשירה ל'UTR 3 של עניין. הערכת בקרות כגון לפני ההקרנה הראשונית מצביעה לא רק את הפונקציונליות של assay פיתח, אלא גם מאפשרת להערכת הטווח, הרגישות שלה הדינמית וביצועים בפורמט התפוקה גבוהה.
באמצעות הפרוטוקול המתואר הוקרן ספריית 2,000 מתחם 6. נוירובלסטומה, הגידולים מוצקים extracranial הנפוצים ביותר של גיל הינקות, שימשה כמודל ביולוגי ו'UTR 3 של אונקוגן MYCN, הגברה שמאוד מנבא תוצאות שליליות של נוירובלסטומה, כגן מטרה 7. איור 2 מתארים את הפריסה הניסיונית. ההקרנה הייתה מחולקת בשלוש ריצות עם גודל אצווה של 27 צלחות הוקרנו בטווח אחד. הקבוצה של 27 צלחות כלולות ספריית ספקטרום אוסףצלחות הערת 1-N.8 + n.25 (הפעלה ראשונה), n.9-n.16 + n.25 (ריצה שנייה) וn.16-n.24 + n.25 (סיבוב שלישי), כל אחד צלחת הוקרנה בשלושה עותקים. כך, צלחת אחת ספרייה (n.25) הייתה assayed בתוך כל שלוש הריצות עושים השוואה בין-טווח אפשרי. הפרוטוקול להלן מתאר ריצה אחת של 9 צלחות ספרייה נבדקו בשלושה עותקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
