Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Sowohl der Transkription und post-transkriptionelle Regulation haben einen großen Einfluss auf Gene Expression. Jedoch konzentrieren sich allgemein angenommen zellbasierten Screening-Assays auf der transkriptionellen Regulation, wobei im wesentlichen auf die Identifizierung von Promotor-Targeting-Moleküle ab. Dadurch werden posttranskriptionale Mechanismen weitgehend durch Genexpression gezielte Medikamentenentwicklung aufgedeckt. Hier beschreiben wir ein Assay auf Zellbasis bei der Untersuchung der Rolle von der 3'-untranslatierten Region (3 'UTR) in der Modulation des Schicksal der mRNA ist, sowie für die Identifizierung von Verbindungen in der Lage, ihn zu ändern. Der Test basiert auf der Verwendung eines Luziferase-Reporterkonstrukt, das die 3'-UTR des Gens von Interesse stabil in einer krankheitsrelevanten Zelllinie integriert basiert. Das Protokoll wird in zwei Teile aufgeteilt, wobei die anfängliche Konzentration auf der primären Screening auf die Identifizierung von Molekülen beeinflussen Luciferase-Aktivität nach 24 Stunden der Behandlung ab. Der zweite Teil des Protokollbeschreibt die Gegen Screening notwendig, Verbindungen modulieren Luciferase-Aktivität spezifisch durch die 3'-UTR diskriminieren. Neben dem detaillierten Protokoll und repräsentative Ergebnisse stellen wir wichtige Überlegungen über die Assay-Entwicklung und bei der Validierung des Treffers (en) des endogenen Ziel. Die beschriebene zellbasierten Reportergentest ermöglicht es den Wissenschaftlern, um Moleküle zu modulieren Protein-Ebene über posttranskriptionale Mechanismen abhängig von einer 3'-UTR identifizieren.
Introduction
Für eine lange Zeit der Transkriptionsregulation der Genexpression wurde gedacht, eine wichtige, wenn nicht ausschließliche Rolle bei der Kontrolle der Proteinproduktion zu spielen. Immer mehr deutet jedoch an, dass nach der Transkriptionsregulation trägt so viel, wenn nicht mehr als, Transkriptionsregulation, zelluläre Proteinmenge 1,2 zu bestimmen. Post-Transkriptionskontrolle der Genexpression ist viel komplexer und aufwendiger, als es auf den ersten Gedanken. In der Tat, alle verschiedenen Phasen der Post-Transkriptionskontrolle sind entstanden, um zu regeln, einschließlich mRNA-Prozessierung, Lokalisierung, Umsatz, Übersetzung 3 sowie die neu beschriebene reversible RNA-Methylierung 4. Aus einer Reihe von post-transkriptionale Regulationsprozesse potenziell betroffenen nachfolgend beschriebene Test konzentriert sich auf solche, die 'untranslatierten Region (3'-mRNA 3 UTR). 3'UTR breit wirkt mRNA Schicksal hauptsächlich über spezifische Wechselwirkung von RNA-bindenden proteins und nicht-kodierenden RNAs seine regulatorischen Sequenzen und / oder Sekundärstrukturen 5. Daher werden kleine Moleküle, die diese Interaktionen zu verändern oder beeinträchtigen aufwärts Signaltransduktionswege die Balance, die Proteinmenge reguliert verschieben. Dieser Therapieansatz ist für den menschlichen Krankheiten, für die Beweise vorliegen, die zeigen, dass krankheitsrelevante Gene zu posttranskriptionale Verordnung, die somit eine potenzielles Ziel für pharmakologische Intervention ausgesetzt besonderer Bedeutung. Daher können Systeme erlauben zum Screenen von mRNA-Niveaus "Modulatoren durch Beeinträchtigung posttranskriptionalen Kontrollmechanismen in einem Hochdurchsatzformat wertvolle Hilfsmittel bei der Identifizierung von potentiellen neuen Medikamenten zu werden.
Die beschriebenen zellbasierten Reportergentest erlaubt die Identifizierung von Verbindungen, die mRNA Schicksal über Mechanismen abhängig von seinem 3 'UTR modulieren. Es besteht aus mehreren Haupt cBAUTEILE (Abbildung 1) und erfordert einige vorbereitende Schritte, um die Durchführbarkeit des Assays zu überprüfen. Zunächst wird das Reporterkonstrukt entworfen, um das 3'-UTR von einem Gen in der Nähe sind. Die 3'-UTR an das Ende eines Reportergens wie Luciferase (1) verschmolzen ist. Alle Änderungen, die in der posttranskriptionellen Kontrolle Mechanismen, durch die eingelegte 3'UTR ausgeübt wird, die Stabilität und / oder Translationseffizienz dieses chimären Transkript zu verändern, was zu vielfältigen Luciferase Ebenen. Daher ändert der Luciferaseaktivität dienen als indirektes Maß der betroffenen posttranskriptionale Regulation des Gens von Interesse. Die zweite Komponente des Systems ist ein Steuerreporterkonstrukt eine identische Expressionsplasmid, das das gleiche Reportergen exprimiert, jedoch keine 3'-UTR enthalten. Die beiden Reporter Plasmide können im Labor konzipiert mit konventionellen Molekularbiologie Protokolle werden oder von kommerziellen Quellen bezogen.
Die Auswahl einer geeigneten Zelllinie ist für den Assay Konstruktion. Welche Zelllinie ist die optimale Modell hängt von zahlreichen Faktoren, die von klinischen Anforderungen wie maximale Ähnlichkeit mit Pathologie, nur praktische Fragen wie Verfügbarkeit, Transfizierbarkeit und Wachstumseigenschaften. Wichtig ist, dass vor gehen sollte man sicherstellen, dass die Fusion des 3'-UTR an den Reporter-Gen einen erwarteten Einfluß auf die Höhe des chimären Transkript. Das Fehlen signifikanter Unterschied in Luciferase-Signal von dem 3'-UTR-Lager und Steuerreporterkonstrukte transient in den ausgewählten Zellen transfiziert würde, dass der 3'-UTR ist nicht funktionsfähig in diesem zellulären Modell, woraufhin zur Suche von anderen vorge. Für die Hochdurchsatz-Format, müssen die 3 'UTR-Lager und Steuer Luciferase-Reporter-Konstrukte stabil in der gewählten Zelllinie integriert werden. Mit einem stabil über transient transfiziert integriertZelllinie ist bevorzugt aus mehreren Gründen. Dadurch wird die Auswahl einer zellulären Modell inklusive schwer zu transfizierenden Zelllinien zu erweitern, verringern die Variabilität in den Daten, die aus Schwankungen der Transfektionseffizienz, sinken die Kosten. Außerdem, auf transiente Transfektion Zellen werden sehr oft mit einem DNA-Plasmid, die zur Sättigung des Systems überlastet. In diesen Einstellungen eine weitere Erhöhung der Reporterexpression könnte eine Herausforderung sein, was zu einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber potenziellen upregulating Verbindungen.
Schließlich, wenn alle Testkomponenten eingerichtet sind, ist es kritisch, bevor er in die Hochdurchsatz-Format, um die Durchführbarkeit des Tests bestimmen, dh, ob die Luciferase-Aktivität kann in der Tat nach oben und nach unten reguliert und zwar über dem eingesetzten 3 'sein UTR. Die besten Kontrollen wären kleine Moleküle berichtet, dass die Stabilität oder die Übersetzbarkeit der mRNA durch die 3'-UTR von Interesse zu modulieren. Wenn mit diesen istnicht möglich ist, werden Ersatzkontrollen imitieren die gewünschte Wirkung angenommen. Diese könnten miRNAs oder RNA-Bindungsproteine bekannt, ihre Wirkung über die Bindung an der 3'-UTR von Interesse auszuüben. Auswertung solcher Kontrollen vor dem primären Screening zeigt nicht nur die Funktionalität des entwickelten Assays, sondern ermöglicht auch eine Schätzung seiner Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und Leistung in der Hochdurchsatz-Format.
Mit dem beschriebenen Protokoll wir abgeschirmte eine 2.000-Substanzbibliothek 6. Neuroblastom, die häufigste extrakranielle solide Tumor des Kindesalters, wurde als biologisches Modell verwendet und die 3'-UTR des MYCN Onkogen, dessen Verstärkung stark prognostiziert negativen Ergebnis von Neuroblastom, als Zielgen 7. Abbildung 2 skizziert die Versuchsanordnung. Das Screening wurde in drei Durchgängen mit der Chargengröße von 27 Platten in einem Arbeitsgang abgeschirmt unterteilt. Die Charge von 27 Platten enthalten Spectrum Kollektion BibliothekPlatten n.1-n.8 + n.25 (zum ersten Mal ausgeführt), n.9-n.16 + n.25 (zweiten Lauf) und n.16-n.24 + n.25 (dritte Piste), jeweils Platte dreifach abgeschirmt. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek Platte (n.25) in allen drei Läufen die Ermöglichung interLauf Vergleich untersucht. Das Protokoll beschreibt eine einzige Serie von 9 dreifach getestet Bibliotheksplatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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