Abstract
Selvlysende Identifikation af Funktionelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) giver mulighed for hurtig identifikation af mål for specifikke miRNA inden for en bred vifte af hundredvis af forespørges 3'UTRs. Mål identifikation er baseret på en dobbelt-luciferase assay, der påviser bindende på mRNA-niveauet ved at måle translationel output, hvilket giver en funktionel udlæsning af miRNA målretning. 3'LIFE anvender ikke-navnebeskyttede buffere og reagenser og offentligt tilgængelige reporter biblioteker, hvilket gør genom-dækkende skærme gennemførlig og omkostningseffektiv. 3'LIFE kan udføres enten i en standard laboratorium indstilling eller skaleres op ved hjælp af flydende håndtering robotter og andre high-throughput instrumentering. Vi illustrerer den fremgangsmåde under anvendelse af en datasæt af humane 3'UTRs klonet i 96-brønds plader, og to test miRNA, lad-7c og miR-10b. Vi viser, hvordan man udfører DNA-fremstilling, transfektion, celledyrkning og luciferaseassays i 96-brønds format, og udvikle redskaber til dataanalyse. Afslutningsvis 3'LIFE er meget reproducerbar, hurtig, systematisk, og identificerer høje tillid mål.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at opdage og præcist kortlægge microRNA (miRNA) mål i high-throughput. MiRNA er endogene ikke-kodende RNA'er ~ 22 nukleotider lange. Efter transkription og forarbejdningen modne miRNA inkorporeres i et protein kompleks kaldet RNA inducerede silencing kompleks (RISC). Hver miRNA guider RISC at målrette elementer placeret primært i de 3'-utranslaterede regioner (3'UTRs) af messenger RNA'er (mRNA'er), hvilket resulterer i enten translation repression eller mRNA-spaltning 1. Mirna anerkender target sites baseret på standard Watson-Crick og G: U wobble baseparring, og er degenererede i naturen, der indeholder flere uoverensstemmende basepar og buler regioner. Mange miRNA er stort set bevaret fra planter til mennesker 2,3, hvor de spiller en bred vifte af biologiske roller. I metazoans miRNA kan påvirke flere biologiske processer, herunder celle skæbne beslutninger 4, udviklingsmæssige timing 5 6,7. Mirna misexpression kan også resultere i afvigende genregulering, der kan have væsentlig indflydelse på celle adfærd udelukkende baseret på funktionen af målgener. Som sådan er miRNA bundet til en lang række sygdomme, herunder neurodegeneration 8,9, diabetes 10 og cancer 11. Bioinformatik og våd-bench tilgange antyder, at hver miRNA kan være i stand til at målrette hundreder til tusinder af distinkte mRNA'er 12-14, hvilket indikerer, at high-throughput eller genom tilgange er forpligtet til at probe denne stor pulje af potentielle interaktioner.
Identificere målgener er en kritisk komponent i mekanisk definition miRNA funktion, og at gøre det forskere skal kunne afsløre mål på en stor skala. Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til at identificere miRNA mål, herunder bioinformatiske prædiktionsalgoritmen, high-throughput sekventeringaf målrettet mRNA'er, og reporter assays. Hver af disse fremgangsmåder har iboende styrker og svagheder. Eftersom miRNA målretning er styret af sekvensspecificitet, navnlig af nukleotider 2-6 af miRNA (betegnet frøet region), flere algoritmer er blevet udviklet til at forudsige miRNA mål i hele genomet for mange organismer. Disse algoritmer er uddannet ved hjælp af de observerede baseparring motiver af validerede miRNA mål, og ofte udnytter parametre såsom strenge frø parring, stedet bevaring, og / eller termodynamisk stabilitet 15. Mens disse filtre forfine det store antal formodede mål med tilstrækkelig komplementaritet til kun høje tillidsindikatorer mål, kan de udelukke artsspecifikke og ikke-kanoniske miRNA target sites, som for nylig beviser foreslår er udbredt 16-24. Hertil kommer, at disse forudsigelser ikke hensyn mekanismer mRNA behandling, der udelukker miRNA target sites, såsom alternativ polyadenylering25, RNA-redigering 26, RNA methylering 27, og samarbejdsvillig binding. Som sådan er der rapporteret høje falsk positive og falsk negative for mange algoritmer 22,24,28. Mens disse algoritmer er nyttige til at identificere kandidat miRNA mål for efterfølgende eksperimentel validering, disse høje fejlprocenter begrænser effekten af bioinformatiske metoder til systematisk miRNA target afsløring.
Systematisk sonde for interaktioner mellem en given miRNA og potentielt målrettede 3'UTRs har vi udviklet et high-throughput assay kaldet Luminescent Identifikation af Funktionelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denne assay måler direkte interaktioner og translationelle undertrykkelse af testen 3'UTR ved en forespørgsel miRNA bruger en dual luciferase reporter-system. I dette system er 3'UTR af et gen af interesse klones nedstrøms for ildflue-luciferase (Fluc) reporter læseramme. Reporter construct cotransficeres med en forespørgsel miRNA i HEK293T celler. Mirna målretning bestemmes ved måling af den relative ændring mellem test Fluc :: 3'UTR reporter og en anden ikke-specifik Renilla-luciferase reporter. Vigtigere, luciferaseassays detektere funktionelle miRNA / mRNA-interaktioner, der påvirker den translationelle output af reporter. Det er en afgørende fordel i forhold til traditionelle metoder til at detektere miRNA regulering, såsom RT-qPCR og Western blot, i at dette omgår forskelle i mRNA nedbrydning og translationel undertrykkelse, samt ændringer i protein overflod uafhængig af 3'UTR regulering.
Luciferaseassays er almindeligt anvendt til at validere direkte miRNA mål på grund af deres relative enkelthed og følsomhed, men deres anvendelse i high-throughput skærme er begrænset af høje omkostninger forbundet med reagenser, manglen på 3'UTR biblioteker fra offentlige kilder, og fraværet af standardiserede luciferase protocols, hvilket fører til vanskeligheder med at sammenligne funktionelle undertrykkelse på tværs af flere datasæt. For at lette brugen af 3'LIFE analysen, har vi lagt vægt på forenkling af eksperimentelle design, udnyttelse af ikke-kommercielle transfektion 24 og luciferase reagenser 29, hvilket skaber en 3'UTR bibliotek, som løbende opdateret og udvidet, og er tilgængelig via en offentlig plasmid repository 30.
Skalerbarhed af 3'LIFE analysen muliggør screening af et stort 3'UTR bibliotek til målretning af en given miRNA uden forspænding skærmen fremad bioinformatically identificerede gener. Ud over at teste kanoniske og forudsete vekselvirkninger, denne systematiske tilgang gør det muligt at identificere nye targets drevet via ikke-kanoniske og / eller artsspecifikke interaktioner. Vigtigere, er effekten af miRNA målretning på protein produktionen generelt forstås at resultere i beskedne translationel undertrykkelse 15,31 </ Sup>, hvilket tyder på, at en primær rolle miRNA forordning er at finjustere protein output, beskytter mod afvigende niveauer af genekspression, og giver robusthed til celle specifikke programmer 32,33. Følsomheden af luciferaseassayet kombineret med den iboende store antal negative miRNA / mRNA interaktioner i 3'LIFE skærmen muliggør påvisning af subtile effekter af miRNA målretning på et stort antal gener, og identificering af flere komponenter af gen netværk, er reguleret af en given miRNA 24.
Her beskriver vi 3'LIFE protokollen, og vise det er muligt ved screening to godt karakteriserede miRNA, miR-10b og lad-7c mod et panel af 275 menneskelige 3'UTRs (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture (24-48 timer før transfektion)
- 24-48 timer før transfektion frø en tilstrækkelig mængde HEK293T celler baseret på antallet af 96-brønds plader bliver transficeret.
BEMÆRK: konsistente transfektioner, at plade-celler ved en tilstrækkelig tæthed favoriserer hurtig division, endnu ikke være på mere end 70-90% konfluens ved transfektion. - Hver plade med 96 brønde kræver 9 x 10 6 celler (75.000 celler per brønd, og 120 brønde pr plade at tage højde for anvendelsen af reservoiret og multikanalpipette). Beregn fordoblingstiden af HEK293-celler (typisk ~ 20 timer), og frø det passende antal celler til opnåelse af mindst 9 x 10 6 celler på tidspunktet for transfektion. En 145 mm cirkulær dyrkningsplade er typisk tilstrækkelig til 3 96-brønds transfektioner ved dyrkning til ~ 90% sammenflydning, med ~ 10% af celler, der mangler at reseede en ny plade.
2. Forberedelse før transfektion
_content "> BEMÆRK: Forberedelsen af de buffere og plasmid-DNA i trin 2,0-2,2 bør udføres i dagene forud for transfektion siden udarbejdelsen af disse reagenser kan være tidskrævende.- Humane 3'UTR kloner, der er kompatible med 3'LIFE analysen er tilgængelige via et offentligt plasmid repository 30. Oprense DNA-plasmid manuelt eller med flydende robotter håndtering. Brug en transfektion kvalitet alkalisk lyse mini-prep 96 brønde kit og følg producentens anvisninger. Resuspendere oprensede vektorer til ~ 100 ng / pl per brønd.
BEMÆRK: Utilstrækkelig luciferase signal vil resultere hvis plasmid koncentration falder til under 40 ng / pl. - Opnå pLIFE-miRNA vektorer 30 eller klon ved hjælp af rørledningen i figur 1B 24. Resuspender vektorerne i en koncentration på 500 ng / ul for hvert miRNA og Blank kontrol plasmider.
- På grund af følsomheden af de nucleofection bufferbetingelser, sikre, atden samlede mængde af transficerede materiale (herunder celler og plasmider) ikke overstiger 10% af den samlede væske i hver brønd på 96-brønds plade transfektion. For at opnå dette, koncentrere pLIFE-miRNA plasmid lager i en koncentration på mindst 500 ng / pl.
- Forbered 10x ildflueluciferase buffer reagenser (tabel 1), og 1x Renilla luciferase buffer reagenser (tabel 2), der kan gemmes i op til 6 måneder.
BEMÆRK: DTT i ildflue-luciferase bufferen skal der skal opbevares i opløsning ved -20 ° C i engangsbrug alikvoter.
3. Forbered følgende punkter Umiddelbart forud for transfektion
- Forberede transfektion buffer indeholdende PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Forberede denne friske, selv om det kan opbevares i op til 1 måned ved 4 ° C uden mærkbare fald i transfektionseffektivitet. Ved formulering buffer og plasmid DNA-voluminer, antager 120 reaktioner for hver 96-brønds plade til sufficiently redegøre for fejl i pipettering og tabt under anvendelse af flydende reservoirer og multikanalpipetter volumen. Portion 18 pi per brønd transfektion buffer (120 brønde / 96-brønds plade = 2,16 ml per plade), og der er afsat.
BEMÆRK: celle-Elektroporeringsindretning er ekstremt følsomme over for bufferbetingelserne anvendes til transfektion af celler. Nøjagtighed, når forbereder buffere sikrer ensartet ydelse af udstyret. Der skal træffes ekstra forsigtighed ved udførelse af analysen for at forhindre fordampning af buffere, specifikt ved at minimere den tid, bufferen efterlades udækket i mikrocentrifugerør, plader med 96 brønde, reservoirer og elektrodeplader. - Reserve fire brønde til følgende kontroller, ingen pLIFE-3'UTR (til at måle baggrund af luciferaseanalyse), pLIFE-SV40 3'UTR (negativ target kontrol), positiv kontrol for miRNA # 1, positiv kontrol for miRNA # 2.
BEMÆRK: Disse vektorer er offentligt tilgængelige 30. Alternativt eventuelle tidligere valideret targetkan anvendes som en positiv kontrol. - Varme medier, trypsin (0,25%) til 37 ° C.
- Til hver brønd i 96-brønds celledyrkningsplade, der tilsættes 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS, 1% Pen / Strep og anbragt i et 37 ° C inkubator til anvendelse efter transfektion.
- Tænd alle celle elektroporation enheder efterfulgt af den understøttende software. Brug Pulse code FF120 for HEK293T celler og PBS / HEPES-puffer.
4. Fremstilling af plasmid-DNA og Cell Blanding
BEMÆRK: Følgende protokol antager transfektion tre plader med 96 brønde i et eksperiment for en skærm med to miRNA (miRNA- # 1 og miRNA- 2 #). Hver plade vil svare til den samme 96-brønds plade af pLIFE-3'UTR plasmider, og behandles tre gange med pLIFE-miRNA-tom, pLIFE-miRNA- # 1, eller pLIFE-miRNA- # 2.
- Forbered 3 lagre af pLIFE-miRNA + transfektion buffer for hver miRNA. Denne bestand bør tegne sig for 50% (10 ul) af den samlede volumen af hvergodt, multipliceret med 120 brønde. Således bør hver bestand indeholde 1,08 ml buffer + 120 pi plasmid-DNA (pLIFE-miRNA).
- Fjerne celler fra 145 mm dyrkningsplade ved eluering medier, vask forsigtigt med PBS, og behandling med ~ 5 ml 0,25% trypsin i 5 minutter ved 37 ° C. Neutralisere trypsin med et lige volumen af medier, og pellet celler ved 300 x g i 5 min.
- Fjern trypsin / media, og resuspender pellet i ~ 5-10 ml medier (afhængigt af celletæthed og nøjagtig vifte af celle tæller).
- Tæl celler under anvendelse af en celletæller. Sørg for, at cellerne er> 95% levedygtige og inden nøjagtig vifte af maskine.
BEMÆRK: En unøjagtig celletal kan skyldes ekstremt høje cellekoncentrationer (> 6.0x 10 6 / ml). Transfektion af for mange celler kan drastisk reducere effektiviteten af miRNA målretning ved at reducere plasmid: celle-forhold og / eller faldende transfektionseffektivitet. - Alikvote tre rør hver indeholdende 9 x 10 6 celler, svarende til cellerne required til transfektion af en 96-brønds plade. Spin celler ved 300 xg i 3 min.
- Fjern medier. Sørg for at fjerne så meget medier som muligt med minimal forstyrrelse af pillen som overskydende medier kan påvirke transfektionseffektiviteten.
- Resuspender cellerne i 1,2 ml transfektion buffer / miRNA-plasmid-blanding, og der er afsat.
- De følgende trin detalje resuspension af pLIFE-3'UTR plasmid i transfektion buffer. Sker dette i 96 brønds plader, sørge for at undgå fordampning af puffer ved at dække pladerne på alle tidspunkter.
- Hjælp af en multikanalpipette, flytte 32.4 pi transfektion buffer i hver brønd i en 96 brønds PCR-plade (9 pi [pr transfektion] * 3 [plader] * 1.2 [redegøre for pipette error]).
- Tilføj 3,6 pi (~ 100 ng / pl) i mini-prepped pLIFE-3'UTR plasmid til hver brønd, og bland grundigt.
- Afpipetteres 10 pi af denne blanding til hver brønd i 96-brønds transfektion plade og dække.
- Flyt 1,2 ml af den første celle / puffer / pLIFE-miRNA plasmid blanding i reservoiret. Bland godt.
- Tilsæt 10 ul af denne blanding i den første 96-brønds plade transfektion allerede indeholdende 10 pi transfektionsbuffer / pLIFE-3'UTR. Bland godt ved pipettering op og ned adskillige gange.
BEMÆRK: Lige suspension af celler i bufferen vil sikre jævn og grundig passage af elektrisk strøm gennem kuvetten og maksimere transfektionseffektivitet. - Placer 96-brønds plade transfektion på cellen Elektroporeringsindretning og initiere transfektion.
- Når transfektion er komplet, tilsættes 100 pi forvarmet medier fra 96-brønds dyrkningsplade til hver brønd af 96-brønds plade transfektion og bland godt. Flytte 100 pi fra hver brønd i 96-brønds dyrkningsplade.
- Bland celler i kultur plade med pipette anbringes lodret i midten af brønden, som celler vil have tendens til at aggregere på siderne af well medmindre blandet ordentligt.
- Gentag 5,1-5,5 for de resterende to plader.
- Rengøring 96-brønds plade transfektion
- 96 brønds-plader transfektionsteknikker kan genbruges ved vask med 70% EtOH at sikre, at ingen Restkoncentrationen af nukleinsyrer mellem eksperimenter. Udfør to 70% EtOH vasker ved hjælp af en sprayflaske til helt at fylde hver brønd, efterfulgt af aftørring ned overskydende EtOH på elektroden strips (nederst side) og lade transfektions- plader til helt tør i kulturen hætte.
BEMÆRK: Vi har testet for fremførsel DNA-kontaminering ved transfektion 12 brønde med 2 ug plasmid pmaxGFP hver ind HEK293T celler, efterfulgt af en enkelt vask med 70% EtOH, og en anden transfektion uden plasmid-DNA. Med denne ekstremt høj koncentration plasmid, meget lyse reporter, og en enkelt vask, var der ingen observerbar fluorescens i nogen af de 12 gentagne transfektioner.
- 96 brønds-plader transfektionsteknikker kan genbruges ved vask med 70% EtOH at sikre, at ingen Restkoncentrationen af nukleinsyrer mellem eksperimenter. Udfør to 70% EtOH vasker ved hjælp af en sprayflaske til helt at fylde hver brønd, efterfulgt af aftørring ned overskydende EtOH på elektroden strips (nederst side) og lade transfektions- plader til helt tør i kulturen hætte.
- Dyrke celler i 48-72 timer ved 37 ° C efterfulgt af den dobbelte lucifslette assay.
6. cellelysatet Forberedelse til Luciferase Assay
- Fortynd lysepuffer med 4 dele vand, 1 del 5x passiv lysepuffer i et reservoir. Beregn 26 pl / brønd, tilføjer ~ 20 ekstra mængder for at tage højde for tab i reservoiret.
BEMÆRK: Buffer opbevares ved -20 ºC og kan være yderst viskøs, således før tillader 5x buffer at nærme stuetemperatur vil forbedre pipettering nøjagtighed. - Analyser hver brønd for transfektionseffektivitet ved anvendelse af fluorescensmikroskopi. Bemærk eventuelle uoverensstemmelser i brønde, der ikke transficere effektivt (> 90% transfektion effektivitet), eller udtrykker lave niveauer af RFP tegn på overbelægning eller medie udmattelse. Fjern disse brønde fra analysen.
- Helt fjerne mediet fra cellerne, og pas på ikke at eluere for hurtigt, som vil få celler til at løsne.
BEMÆRK: Resterende medier vil udvande udsving lysatet og årsag i værdier på tværs experimeNTS. - Tilføje 26 pi lysepuffer til hver brønd, og sted på en pladeryster / rocker ved lav / moderat hastighed for ~ 20-30 min. Brug denne tid til at forberede luciferase buffere, vaske og prime luminometeret (r), og overføre lysat til uigennemsigtige måling plader.
7. Dual Luciferase Assay
BEMÆRK: Hvis der er flere plader bliver målt sekventielt på en luminometer, oprette buffer master-mix med alt undtagen ATP og substrater, tilføjer disse reagenser efterfulgt af pH-justering umiddelbart før brug med hver plade. ATP og substrater kan nedbrydes med tiden; konsistens i mængden af tid, disse reagenser er i bufferen vil forbedre sammenhængen på tværs af flere plader.
- Forbered 1x luciferase buffere (tabel 1):
- Wrap to rør (typisk 15/50 ml centrifugerør) indeholdende ildflue og Renilla buffere med aluminiumsfolie, som substrater kan være lysfølsom.
- Forbered 1x Firefly luciferase puffer. Der tilsættes 1 ml hver af de fem 10x ildflueluciferase reagenser, tilføjer EGTA sidste, til 5 ml H 2 0 til en endelig 1x koncentration.
- Tilføj 0,025 g ATP til 10 ml 1x ildflue puffer. Bland ved at vende flere gange. Hold ATP på is hele tiden. ATP vil nedbrydes, så hvis måling mere end én plade sekventielt, skal buffer gøres frisk start på dette trin for hver ekstra plade.
- Tilføj 100 ul 100 bille luciferin (substrat) (Tabel 1) Buffer bør ændres til gullig farve baseret på pH.
- 1x Renilla luciferase buffer rekonstituering: Per plade med 96 brønde, alikvot 10 ml 1 "Renilla buffer".
- Tilsættes 100 pi BSA (44 mg / ml stock).
- Hvis screening mere end én plade, separat master mix i 10 ml alikvoter.
- Tilsættes 100 pi coelenterazine til buffer (tidligere alikvoteret og opbevaret ved 100x konc.)
<li> Indstil pH af 1x ildflue buffer til 8,0, efterfulgt af 1x Renilla puffer til 5,0 under anvendelse af NaOH og HCl.
BEMÆRK: Aktiviteten af hver buffer, og evnen af Renilla puffer til standsning af Firefly luciferaseaktivitet er meget afhængig af pH. For ensartede resultater være ekstremt præcis i dette trin. - Bringe volumen af hver puffer (svarende til 1 plade med 96 brønde) til 10,5 ml rumme luminometer priming.
- Vælg brøndene til at være tseret (alle brønde er standard).
- Udvid "Forsinkelse før måling" indstillingen til 5 sekunder, med en 10 sek måletid (se 29 for forklaring).
- Kapillære vasketrin: vand 3x, EtOH 3x, vand 3x, tør 3x. Prime buffere gang ind i affald og derefter prime anden gang tilbage i bufferen rør til at sikre opblanding. Injicere ildflue buffer først og prime det i venstre kapillær, efterfulgt af Renilla i den rigtige kapillær.
BEMÆRK: Flere plader kan læses og data gemt på den samme excel fil, men problemer kan opstå med flere plade læser hvor luminometer programmet vil gå ned. Sørg for at gemme alle data mellem målingerne og tage screenshots, hvis programmet går ned, før gem er mulig.
- Erstatte gamle bufferemed nye, og sørg for at prime mindst to gange med nye buffere, før du starter den nye plade.
8. Data Analysis
- Udnyt Excel-tabeller "3'LIFE - enkelt plade analyse" og "3'LIFE - multiplate analyse" tilgængelig fra www.mangonelab.com . Kopier rå data for ildflue og Renilla luciferase målinger fra luminometer output fil i steder, der svarer til den negative tilstand, miRNA # 1, og miRNA # 2 i "3'LIFE - enkelt plade analyse" regneark.
- Regnearket vil automatisk beregne ildflue / Renilla-forholdet og normalisere hver miRNA til den relevante negative kontrol, og normalisere undertrykkelse værdier på tværs af hver plade.
BEMÆRK: Denne regneark vil automatisk identificere brønde med lavt luciferase signal, fremhæve betydeligt fortrængte brønde, og et mål for repressipå tværs af hele pladen. Se 24 for detaljeret forklaring af statistisk analyse.- Kopiere værdierne fra "Normalized RI Index" kasse, ind i tilsvarende celler i "3'LIFE - multiplate analyse" regneark i positionen svarende til replikere # 1 for hvert afprøvet miRNA. Gentag for alle biologiske replikater udført på forskellige dage.
- Hvis det ønskes, indsætte gen navne og mål forudsigelse status i kolonne B og D hhv.
- Lad regnearket til automatisk at beregne gennemsnittet af alle pladen. Observere data i 96 brønd format som en varme kort (figur 2). Filen arrangerer også data i listeformat (Figur 2).
BEMÆRK: repression indekset er et mål bruges til at identificere formodede miRNA mål. Forskellige stringens parametre kan anvendes, baseret på individuelle præferencer. I gennemsnit ser vi sandsynlige hits under undertrykkelse indeks på 0.8 og statistisk signifikant ved t-test (p-værdi <0,05). Som vist i figur 3 potentielle mål på grundlag af disse kriterier vil blive fremhævet med rødt.
- Lad regnearket til automatisk at beregne gennemsnittet af alle pladen. Observere data i 96 brønd format som en varme kort (figur 2). Filen arrangerer også data i listeformat (Figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Luminometeret output fil indeholder rå målinger for både ildflue og Renilla luciferase proteiner. Denne rå format er kompatibelt med "3'LIFE - enkelt plade analyse" og "3'LIFE - multiplate analyse" regneark tilgængelig fra Mangone lab hjemmeside ( www.mangonelab.com ). Den enkelt plade analyse regneark beregner automatisk ildflue / Renilla ratio, normaliserer hver miRNA til den relevante negative kontrol, og normaliserer undertrykkelse værdier på tværs af hver plade. Dette regneark identificerer automatisk brønde med lav Renilla luciferase signal, fremhæver brønde, der udviser undertrykkelse sammenlignet med den negative kontrol, samt foranstaltninger undertrykkelse tværs af hele pladen (figur 2). Se 24 for detaljeret forklaring af statistisk analyse.
Flere replikater kan analysered ved hjælp af "multiplate analyse" regneark. Hver gentagelse sammenlignes side om side, og statistiske foranstaltninger af dataene beregnes automatisk (Figur 3). Ud over at sammenligne replikater med "Normaliseret undertrykkelse" kolonnerne kan brugeren sammenligne undertrykkelse mellem de to miRNA under "miRNA # 1 / miRNA # 2" kolonner. Denne foranstaltning opdeler undertrykkelse indeks for hver miRNA for hver replikat. Denne foranstaltning kan indikere fejlagtige værdier fra luciferaseassayet (f.eks unormalt høje eller lave aflæsninger med den negative kontrol, se figur 3, række A9, Rep # 3) og brønde, hvor undertrykkelsen indekset kan ikke tyde væsentlig undertrykkelse, men det gør udviser betydelige forskelle mellem miRNA. Mens denne foranstaltning må ikke anvendes direkte til at angive en miRNA mål, er det nyttigt til at identificere outliers, problematiske brønde, eller mønstre i data, der ikke udelukkende tilskrives direkte miRNA repå reguleringen.
Den Undertrykkelse Index (RI) bruges til at kalde en formodet miRNA mål, med lavere værdier svarende til højere relativ undertrykkelse. Tærsklen for at kalde formodede mål er baseret på niveauet af stringens kræves af forskeren, men kombinere RI med 3'UTRs der viser statistisk signifikante p-værdier (p <0,05) vil indikere høj tillid mål (se figur 2 Rækker B8 og B12).
Figur 1: 3'LIFE Assay (A). Gateway-kompatible vektorer, der anvendes i 3'LIFE assayet. Top: luciferasegenet (Fluc) er fusioneret til test 3'UTR, mens Renilla luciferasegenet (Rluc) er fusioneret til uspecifik SV40 pA 3'UTR som kontrol. Nederst: Den RFP- miRNA-intron vektor - Sonden pre-miRNA, plus ~ 400nukleotider inden for sit genomiske locus (at rekapitulere endogene miRNA forarbejdning), er klonet i en intron ved sin co-udtryk med DSRed2 fluorokrom. Begge vektorer er offentligt tilgængelige (Seiler et al., 2013). (B) Flow diagram af 3'LIFE analysen. (C) 3'LIFE Pipeline: To-luciferase vektor indeholdende test 3'UTR med eller uden miRNA vektorer cotransficeres ind HEK293-celler i 96-brønds plader. Samspillet mellem miRNA og en bona fide 3'UTR mål vil sænke den relative luminescens i specifikke brønde (eksemplificeret ved den orange plet i den eksperimentelle plade).
Figur 2: Eksempel på data produceret med 3'LIFE assay. Hver probe miRNA testes i fire eksemplarer (replikater 1-4). Farver repræsenterer undertrykkelse niveauer, med rødfarver indikerer stærk miRNA / 3'UTR interaktion. Alle gentagelser midles til at producere høj kvalitet formodede mål vist i resuméet pladen under den gule pil. Hvide boks repræsenterer kontroller mislykkedes transfektioner eller brønde med lavt transfektion effektivitet.
Figur 3:. Tabel repræsenterer summariske data for en delmængde af interaktioner fremstillet under anvendelse af 3'LIFE regneark undertrykkelsen værdier er som i figur 2. Softwaren beregner standardafvigelsen, standardfejl og z-score for hver interaktion. Statistisk signifikante interaktioner er markeret med rødt. De sidste fire rækker viser relative undertrykkelse af en miRNA til den anden, og anvendes som sekundær indikator til at sammenligne undertrykkelse mellem to forskellige miRNA. Regnearket kan downloades fra www.mangonelab.com
| Ildflue luciferase buffer reagenser | Slutkoncentration (1x) |
| Glycylglycin | 25 mM |
| K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mM |
| MgSO4 | 15 mM |
| DTT (opbevares ved 4º) | 1 mM |
| EGTA | 4 mM |
| ATP * | 2 mM |
| Beetle luciferin * | 250 uM |
Tabel 1: Stock ildflueluciferase reagenser: 10x Stamopløsninger af Glycylglycin, K x PO 4, MgSO4, DTT og EGTA kan fremstilles separat og opbevares inden buffer rekonstitution. 100x Beetle Luciferin (ildflue-luciferase substrat) kan være butikd ved at opløse 50 mg luciferin i 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Portion 105 ul / plade af opløst Beetle luciferin i rør og opbevares ved -80 ºC. Per Promega teknisk support, bør dette være stabile i> 6 måneder, men kan være lysfølsom. BEMÆRK: EGTA vil ikke gå i opløsning ved neutral pH. Tilsæt langsomt NaOH til EGTA, indtil det er fuldstændigt opløst. * Reagenser tilsættes til endelige buffer umiddelbart før luciferase-assayet
| Renilla luciferase buffer reagenser | Slutkoncentration (1x) |
| NaCl | 1,1 M |
| Na2EDTA | 2.2 mM |
| KH 2 PO 4 | .22 M |
| NaN3 | 1.3 mM |
| BSA * | .44 Mg / ml |
| Coelenterazin * | 2.5 & #956; M |
Tabel 2: Stock Renilla luciferase buffer reagenser Alle reagenser, undtagen BSA og Coelenterazin kan blandes på en 1x koncentration og opbevares ved stuetemperatur. Coelenterazin kan opløses i sur methanol og alikvoteret pr plade. Forsure methanol ved tilsætning af HCl til en slutkoncentration på 5 mM (<3 pH). Opløs 250 ug coelenterazin i 2,36 ml sur methanol (250 uM) alikvote 105 ul / plade. Blandingen er stabil i mindst 6 måneder, men kan være lysfølsom. * Reagenser tilsættes umiddelbart til buffer før luciferase assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 3'LIFE analysen identificerer funktionelle miRNA mål i 3'UTRs i high-throughput. Dette assay er nyttig for forskere, der ønsker at eksperimentelt identificere et stort antal formodede mål for deres miRNA af interesse. Den 3'LIFE assayet er en kraftfuld metode til at søge efter 3'UTR drevet regulering, idet assay tilvejebringer en funktionel mål for miRNA målretning og den binære afprøvning af en enkelt reporter :: 3'UTR mod en enkelt miRNA kan trygt tage fat den målsøgende status for individuelle gener. For at validere denne tilgang, vi screenede et panel af 275 3'UTRs og mod to miRNA, lad-7c og miR-10b, og omfattede 10 tidligere validerede target gener i dette bibliotek. Otte af disse ti gener udviste undertrykkelse 24. Vi observerede også en betydelig berigelse af validerede bioinformatically forudsagte mål, og uforudsete 3'UTRs der indeholder kanoniske frø elementer blandt vores top hits, suggesting at 3'LIFE er i stand til at identificere bona fide miRNA targets.
En vigtig indikator for følsomheden af high-throughput skærme er de falske positive og falske negative priser. Mens den falske positive for dette assay skal evalueres ved brug af yderligere alternative tilgange til at validere hits, otte af de ti positive kontroller inkluderet i vores proof-of-principle skærm udviste undertrykkelse, hvilket antyder en falsk negativ på 20%. Men mange teknikker, der anvendes til at identificere miRNA mål i forskellige cellulære sammenhænge, og 3'UTR behandling og regulering af trans-virkende faktorer er kendt for at være yderst vævsspecifik. For eksempel de fleste 3'UTRs indeholde multiple polyadenyleringssteder, som styrer længden af 3'UTR i det modne mRNA. I mange tilfælde er brugen af proximale polyadenyleringssteder er vævsspecifik og kan udelukke miRNA målsteder. Derudover kooperative miRNA målretning, konkurrence with RNA-bindende proteiner og mRNA sekundær struktur kan alle konsekvenser evne 3'LIFE at opdage miRNA mål i specifikke væv. På grund af dette, kan påvisningen af mål ved 3'LIFE assayet variere baseret på den cellulære kontekst, hvori assayet udføres, komplicerer evaluering af absolutte fejlrater. Denne protokol er optimeret til HEK293T celler, men alternative cellelinier kan anvendes, hvis forskeren ønsker at udføre analysen i et specifikt biologisk sammenhæng. Optimering af transfektionseffektiviteten og celleoverlevelse med hver cellelinie, vil imidlertid skulle optimeres ved hjælp af flere pufferbetingelser, puls koder, og antallet af celler. Et eksempel på en optimering ordning kan findes på Wolter et al. 24.
Denne protokol er blevet optimeret i 96-brønds format og angiver anvendelsen af visse high-throughput instrumentering. I det tilfælde, at institutionen ikke har det nødvendige udstyr til 96-Nå nucleofection, kunne alternative transfektionsreagenser anvendes til at udføre den 3'LIFE assayet, så længe transfektionseffektiviteten fortsat høj. Derudover luciferaseanalyse er den mest tidskrævende aspekt af 3'LIFE assay. Som sådan, anbefales det at brugen af flere luminometre for high-throughput skærme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P.
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al.
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al.
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
