세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에<em> 폐렴 구균</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
유전자 발현 및 조절은 반응 조건이 다른 셀들의 동작을 이해하는 것이 매우 중요하다. 다양한 기술이 유전자 발현을 연구하기 위해 현재 사용되지만, 대부분의 전 사체의 발현을 제공하는 전체 화상의 관점에서 제한된다. DNA 마이크로 어레이는 전체 유전자 발현의 전체 개요를 제공 빠르고 경제적 연구 기술을 제공하고 수천을 분석하는데 도움도 사이트, 세포의 전사 활성의 특성화 및 바인딩 신규 유전자 전사 인자의 확인을 포함하여 광범위한 응용 번호를 가지고 유전자 (하나의 실험에서). 본 연구에서, DNA 마이크로 어레이 분석 세포 수확에서 세균 전 사체 분석을위한 조건이 최적화되어있다. 계정으로 시간, 비용과 실험의 정확성을 촬영,이 기술 플랫폼은 세균 transcripto 연구를위한 매우 유용하고 보편적 applicabale 것으로 입증MES. 여기서 우리는 S.의 전사 반응을 비교하여 대소 연구 등의 폐렴 구균과 DNA 마이크로 어레이 분석을 수행 폐렴 L 배지에 세린의 다양한 농도의 존재 하에서 성장. 총 RNA는 RNA의 품질 검사 키트를 사용하여 조사 하였다 RNA 분리 키트 및 RNA의 품질을 사용하여 Macaloid 방법을 사용하여 단리 하였다. cDNA를 역전사 효소를 사용하여 제조하고, cDNA를 시료는 두 아민 반응성 형광 염료 중 하나를 사용하여 라벨링 하였다. 제 DNA 마이크로 어레이 슬라이드의 cDNA 마이크로 어레이 데이터 전처리 워크 (Microprep)를 사용하여 분석 하였다 표지 된 cDNA 샘플 및 마이크로 어레이 데이터의 혼성화에 사용 하였다. 마지막으로 사이버 T는 통계적으로 유의 한 발현 된 유전자의 식별 Microprep을 이용하여 생성 된 데이터를 분석하는데 사용 하였다. 또한, 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 (고추, FIVA는 공개, 검사, Genome2D)를 분석하는 데 사용되었다데이터.
Introduction
유전자 과발현 또는 녹 – 아웃을 포함하여, 특정 시간 또는 특정 조건 하에서 단세포 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 의해 코딩 mRNA의 풍부 (사체)의 전체 세트의 연구는 transcriptomics 불린다. Transcriptomics 우리가 어느 정도 유전자 시점 X에서 특정 조건에서 발현되는 무엇을 관찰 할 수 있습니다 우리에게 유전자에 대한 참조를 기준으로 표시하는 방법을 강하게에 대한 정보를 제공합니다.
마이크로 어레이는 고체 기판 상에 2 차원 어레이 (일반적으로 유리 슬라이드 또는 실리콘 박막 셀) 높은 처리량 스크리닝을 사용하여 생체 물질의 대량 분석하는 데 사용하고, 소형화 될 수 있고, 다중화 및 병렬 프로세싱 및 검출이며 방법. 마이크로 어레이는 DNA-마이크로 어레이, 단백질 마이크로 어레이, 펩티드 마이크로 어레이, 조직 마이크로 어레이, 항체 마이크로 어레이, 세포 마이크로 어레이 등을 비롯한 다양한 형태로 왔습니다. DNA 마이크로 어레이는기본적 미세한 DNA 스폿의 조립체는 고체 표면에 고정 된 보통 유리. DNA 마이크로 어레이는 유전자의 발현 수준 또는 유전자의 동시 측정하는 세트 또는 게놈 2,3- 복수의 영역의 유전자형을 위해 사용된다. 프로브 Picomoles (10-12 몰) 또한 리포터로 알려진 특정 DNA 서열을 나타내며, 각각의 DNA 스폿 내에 존재한다. 샘플에서 라벨의 mRNA 분자는 '목표'라고합니다. 형광 프로브는 표적과 혼성화 형광 표지 된 표적의 검출을 측정하는 데 사용되는 것은 타겟 핵산 서열의 상대적인 풍부함을 결정한다. 배열 수십 프로브의 수천을 포함 할 수 있기 때문에 마이크로 어레이 실험은 병렬로 여러 유전자 검사를 수행 할 수 있습니다. 간단한 마이크로 어레이 실험의 배치는 그림 1에 나타나있다. 최근에는 이러한 배열은이 기술을 매우 비용 effectiv을 만드는, 재사용하는 것이 우리와 다른 실험실에서 설립되었다전자.
8 – 다른 RNA의 분리 및 정제 기술은 C-TAB, SDS와 GT 방법 4를 포함하여 수년에 걸쳐 개발되고있다. 또한, 여러 상업 키트도 사용할 수 있습니다. 유전자 발현을위한 고품질의 RNA는 매우 중요합니다. 따라서, RNA 분리 방법은 RNA의 최대 양을 얻기 위해 수정됩니다. 마찬가지로, cDNA를 cDNA를 준비 및 라벨링에 대한 단계는 최소화된다. 스캔 한 후 데이터의 정규화는 또한 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 및 도구 (9)를 사용하여 효율적으로 수행된다.
폐렴 구균은 비 인두를 식민지화과 폐렴, 패혈증, 중이염 등의 여러 감염의 원인 10 뇌막염 그람 양성 인간 병원체이다. 박테리아의 성장과 생존에 필요한 11,12 영양소 다양한 이용할 수있다. 연구 번호에 대해 수행 된아미노산의 중요성 및 병독성 13,14에서의 역할을 강조 폐렴 질소 대사 조절. 본 연구에서는 미국의 transcriptomic 응답 폐렴 L 세린, 인간 혈장에 존재하는 다량의 아미노산의 농도 변화에 DNA 마이크로 어레이를 사용하여보고된다. S.의 transcriptomic 응답 세린 L (150 μM)의 농도를 최소 성장 폐렴은 세린의 최대 농도 (10 mM)을 성장에 비해 하였다. 화학적으로 정의 된 배지 (CDM 또는 최소 배지) 15 세린의 농도를 제어하기 위해이 연구를 위해 사용되었다. 본 연구의 초점이 기술은 사용자 친화적 있도록 정상화 데이터 및 분석을위한 다른 도구를 제공하는 것이다. 따라서, 공구의 수는 분석 데이터 해석을 위해 개발되었다. FIVA (기능 정보 뷰어 및 분석기)을 갖는 유전자의 클러스터에 포함 된 정보 처리를위한 플랫폼을 제공합니다유사한 유전자 발현 패턴 및 기능 정보 (16)를 구성하기위한. 검사는 추정되는 기능 및 유전자 주석 (17)의 식별을 용이하게 다른 소프트웨어 패키지이다. 클러스터링 방법을 이용하여 공개는 DNA 결합 부위 검출 알고리즘을 제공한다. 유전자의 시스 – 규정 모티프이 알고리즘 (18)을 통해 투영 될 수있다. Genome2D는 게놈 맵 (19) 상에 유전자 발현 수준의 변화를 특성화하기 위해 상이한 컬러 범위를 제공함으로써 시각화 및 사체 데이터의 분석을위한 윈도우 기반 플랫폼을 제공한다. 고추 웹 서버는 모든 -에 – 하나의 분석 방법, regulons, 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 (20)에 대한 마이닝 도구 상자에 추가로 제공합니다. 박테리아 게놈 유전자 간 영역의 전체 주석이 패키지를 사용함으로써 달성 될 수있다. 이 실험을 설계하는 그들에게 플랫폼을 제공으로 생물 학자들은 크게 고추 혜택을 누릴 수 있습니다(S)이되도록 가정 된 생체 정보 (20)에서 확인할 수있다. 대부분이 무료로 사용할 수 있습니다 및 데이터 표준화 및 분석은 매우 신뢰성있는 이러한 소프트웨어 패키지는 마이크로 어레이 분석에 크게 기여하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세균의 전체 전 사체 분석을 수행하도록 적용될 수있는 사용자 친화적 인 프로토콜을 설명한다. 이러한 특정 기법에 대한 핵심은 세포가 수확되는 조건에 따라 달라질 것이다. 세포 RNA 분리 및 수확 후,이 기술은 박테리아 샘플 모든 유형과 정확히 동일하게 동일한 절차를 따르며, 따라서 세균 배양의 모든 유형에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 매우 간단하고 편리하고 RNA 분리에서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 DNA 마이크로 어레이 슬라이드 생산에 대한 도움말 앤 드 종과 Siger Holsappel 감사합니다. 생물 정보학 분석을위한 앤 드 종의 지원도 받고있다. 우리는 또한 종이를 검토 할 Jelle Slager 감사합니다. 무하마드 아프과 이르판 Manzoor는 HEC 파키스탄의 교수 개발 프로그램에 따라 GC 대학, 파이 살라 바드, 파키스탄에서 지원됩니다.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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