在丝氨酸依赖的基因调控：一个快速和可靠的管道细菌转录组分析案例研究<em>肺炎链球菌</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
基因表达及其调控是了解细胞在不同条件下的行为非常重要。使用各种技术现今研究基因表达，但大部分是在提供全转录的表达的总体图象方面受到限制。 DNA微阵列提供了快速和经济研究的技术，这给全局基因表达的全面概述，并且具有的大量应用，包括鉴定新基因和转录因子结合位点，该细胞的转录活性的表征以及在分析数千个帮助基因（在单次实验）。在本研究中，从细胞收获到DNA微阵列分析细菌转录组分析的条件进行了优化。考虑到时间，成本和实验的精度，该技术平台被证明是非常有用的和普遍applicabale用于研究细菌transcriptoMES。在这里，我们通过对比S的转录反应进行DNA微阵列分析与肺炎链球菌作为一个案例研究肺炎生长在不同的L-丝氨酸的浓度在培养基中的存在。分离总RNA通过使用使用RNA分离试剂盒和RNA的质量Macaloid方法通过使用RNA质量检查试剂盒检查。制备cDNA用逆转录酶和该cDNA样品使用两个胺反应性荧光染料1标记。自制DNA微阵列载玻 片用于标记的cDNA样品和微阵列数据的杂交通过使用cDNA微阵列数据前处理框架（Microprep）进行了分析。最后，网络-T是用来分析使用Microprep为统计学显著差异表达的基因的识别生成的数据。此外，在公司内部建立软件包（辣椒，FIVA，披露，检察官，Genome2D）被用来分析数据。
Introduction
整套的mRNA的丰度（转录组）的在特定时间或在特定条件下的编码通过单细胞生物体或真核细胞的基因组中，包括基因过表达或敲除的研究中，被称为转录。转录使我们能够观察到什么程度的基因都在一个时间点X的特定条件下进行表达，并给了我们如何强烈的基因表达相对于参考信息。
微阵列是在固体基材上的二维阵列（通常是载玻片或硅薄膜电池），它可以被用于使用高通量筛选以测定大量的生物材料，和小型化，复用和并行处理和检测方法。芯片有各种型号，包括DNA，基因芯片，蛋白质芯片，芯片肽，组织芯片，抗体芯片，细胞芯片等。 DNA微阵列是基本上微观DNA斑点的组件固定在固体表面上，通常是玻璃。 DNA微阵列被用于测量的基因的表达水平或一组基因的同时或基因型基因组2,3的多个区域。探针的皮摩尔（10 -12摩尔）的每一个DNA斑点代表特定的DNA序列，也被称为记者中存在。从样品中所述标记的mRNA分子被称为“目标”。荧光团可用于测量探针 – 靶杂交和检测的荧光团标记靶确定靶核酸序列的相对丰度。微阵列实验可以完成多个基因测试在并行，因为数组可能包含探头数以万计。一个简单的微阵列实验的布局示于图1。最近，它建立在我们和其他实验室，这些阵列是可重复使用的，这使得该技术相当高性价比即
不同的RNA的分离和纯化技术已开发多年，包括C-TAB，SDS和GT方法4 – 8。此外，一些商业工具包也可提供。用于基因表达的高品质的RNA是非常重要的。因此，RNA分离方法被修改，以获得RNA的最大数量。同样，步骤进行cDNA制备cDNA的和标签被最小化。还通过内部内置软件包和工具进行9有效扫描后的数据正常化。
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性的人类病原体是定植鼻咽和是多重感染，如肺炎，败血症，中耳炎的病因和脑膜炎10。该细菌可以利用各种所需的生长和存活11,12的营养素。大量的研究已经进行了对肺炎球菌氮代谢和调节强调氨基酸的重要性及其在毒力13,14作用。在这项研究中，S的转录反应肺炎改变L-丝氨酸，氨基酸大量存在的人血浆中的浓度，使用DNA微阵列的报道。 S的 转录反应肺炎在L-丝氨酸（150μM）的最低浓度生长进行比较，在最大浓度（10毫米）的丝氨酸的生长。化学上确定的培养基（CDM或基本培养基）15被用于该研究，以控制丝氨酸的浓度。本研究的焦点是使该技术的用户友好的，并提供对数据归一化和分析不同的工具。因此，许多工具用于分析和数据解释被开发。 FIVA（函数信息查看器和分析器）提供了包含在集群有基因的信息处理平台相似的基因表达模式和构建功能简16。检察官是另一个软件包，有助于推测功能和基因17的注解标识。通过利用聚类方法公开提供了一种DNA结合位点的检测算法。基因的顺 -regulatory图案可以通过使用这种算法18进行投影。 Genome2D通过提供不同颜色范围来表征上的基因组中的地图19中的变化，基因表达水平提供了一个基于Windows的平台，可视化和转录组数据的分析。辣椒Web服务器提供，除了所有功能于一身的分析方法，一个工具箱开采调节子，推动者和转录因子结合位点20。间区域中的细菌基因组完整注释可以通过使用这个包来实现。生物学家可以大大辣椒中受益，因为它为他们提供了一个平台，设计性实验S以便虚拟信息可以在体外 20来确认。这些软件包显著有助于微阵列分析，其中大部分都是免费提供的，使数据标准化和分析非常可靠。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了可应用到执行的细菌的全转录组分析一个用户友好的协议。有关此特定技术的关键点是，在其下收获细胞的情况会有所不同。后收获细胞并分离RNA，该技术变得等于对所有类型的细菌的样品，并遵循完全相同的步骤，因此，可以适用于任何类型的细菌培养物。该协议是很简单的，方便的，并开始从RNA分离。我们的RNA分离协议（使用Macaloid和RNA分离试剂盒）是时间效益，因为相比于传统?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢安妮·德容和西热Holsappel的帮助，DNA微阵列幻灯片制作。安妮·德容的生物信息学分析的支持表示赞赏。我们也感谢耶勒Slager审查的文件。穆罕默德·阿夫扎尔和伊尔凡曼苏尔是由GC大学，费萨拉巴德，巴基斯坦在巴基斯坦HEC的师资队伍建设项目的支持。
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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