Быстрая и надежная Трубопровод Бактериальный Транскриптом Анализ Case Study: серин-зависимой регуляции генов в<em> Пневмококк</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Экспрессия генов и его регулирование очень важно понять поведение клеток в различных условиях. Различные методы используются в настоящее время для изучения экспрессии генов, но большинство из них ограничены в плане предоставления общей картины выражения всей транскриптома. ДНК-микрочипы обеспечивают быстрый и экономическое исследование технологии, которая дает полное представление о глобальной экспрессии генов и имеют огромное количество приложений, включая определение новых генов и сайтов связывания транскрипционных факторов, характеристику транскрипционной активности клеток, а также помочь в анализе тысячи генов (в одном эксперименте). В настоящем исследовании, условия для бактериальной анализа транскриптома от урожая клеток к анализу ДНК микрочипов были оптимизированы. Принимая во внимание время, затраты и точность экспериментов, это технологическая платформа оказывается очень полезным и универсальным applicabale для изучения бактерий transcriptoмес. Здесь мы проводим анализ ДНК микрочипов с Пневмококк как кейс-стади, сравнивая транскрипционные ответы S. пневмонии, выращенные в присутствии различных L-серин концентрации в среде. Общую РНК выделяли с помощью Macaloid метод с использованием набора для выделения РНК и качество РНК была проверена с помощью проверки качества РНК комплект. кДНК получали с использованием обратной транскриптазы и образцы кДНК были помечены с использованием одного из двух аминных реакционноспособных флуоресцентных красителей. Домашние микрочипов слайды ДНК были использованы для гибридизации с мечеными образцов кДНК и данных микрочипов были проанализированы с помощью рамки кДНК микрочипов предварительной обработки данных (Microprep). Наконец, Cyber-T был использован для анализа данных, полученных с помощью Microprep для идентификации статистически значимых дифференциально выраженных генов. Кроме того, в доме, построенные пакеты программного обеспечения (перец, FIVA, раскрывать, прокурора, Genome2D) были использованы для анализаДанные.
Introduction
Изучение всей совокупности мРНК изобилие (транскриптома) кодируется геном одноклеточного организма или эукариотической клетки в определенное время или при определенном состоянии, включая гена повышенной экспрессией или нокаута, называется транскриптомике. Транскриптомике позволяет наблюдать то, что гены экстентов экспрессируется под определенным состоянием в момент времени X и дает нам информацию о том, как сильно гены выражены относительно эталона.
Микрочипов является двумерный массив на твердом субстрате (как правило, предметное стекло или кремний тонкопленочных клетки), которые могут быть использованы для анализа больших количеств биологического материала с помощью высокопроизводительного скрининга, и миниатюрные, мультиплексируются и параллельной обработки и обнаружение методы. Microarrays прийти в различных типов, в том числе ДНК-микрочипов, белковых микрочипов, пептидные микрочипов, ткани микрочипов антител микрочипов, клеточных микрочипов и других. Микрочипов ДНКосновном сборка микроскопических точек ДНК фиксируют на твердой поверхности, как правило, стекла. ДНК-микрочипы используются для измерения уровня экспрессии гена или набор генов одновременно или к генотипу нескольких регионов генома 2,3. Пикомолях (10 -12 моль) зонда присутствуют в каждой точке ДНК, которая представляет собой определенную последовательность ДНК, также известный как репортер. Меченые молекулы мРНК из образцов называют «цели». Флуорофоры используются для измерения гибридизации зонд-мишень и обнаружение меченного флуорофором целей определяет относительное содержание последовательностей нуклеиновых кислот в мишени. Микрочипов эксперимент может выполнить несколько генетических тестов параллельно, потому что массив может содержать десятки тысяч датчиков. Схема простого микрочипов эксперимента показан на рисунке 1. Недавно было установлено, в нашей и других лабораториях, что эти массивы являются многоразовыми, что делает этот технику довольно затрат effectivе.
Различные методы выделения РНК и очистки были разработаны в течение многих лет, включая C-TAB, SDS и методов GT 4 – 8. Кроме того, несколько коммерческих наборов, также доступны. Для экспрессии гена РНК высокого качества очень важно. Таким образом, методы выделения РНК модифицируют, чтобы получить максимальное количество РНК. Кроме того, шаги для подготовки кДНК и маркировки кДНК сведены к минимуму. Нормализация данных после сканирования осуществляется также эффективно, используя в-дом, построенный пакеты и инструменты 9 программного обеспечения.
Пневмококк является грам-положительных человек патогенный микроорганизм, который колонизирует носоглотку и является причиной множества инфекций, таких как пневмония, сепсис, отит и менингит 10. Бактерия может использовать широкий спектр питательных веществ, необходимых для роста и выживания 11,12. Ряд исследований были проведены напневмококковая азотный обмен веществ и регулирование подчеркивая важность аминокислот и их роль в вирулентности 13,14. В этом исследовании, транскриптомных ответ S. пневмонии на изменение концентрации L-серин, аминокислота в изобилии присутствуют в плазме крови человека, сообщается с использованием ДНК-микрочипов. Транскриптомных ответ S. пневмонии выращивают в минимальной концентрации L-серин (150 мкм) по сравнению с выращивали в максимальной концентрации (10 мМ) серина. Химически определенной среде (CDM или минимальной среде) 15 использовали в этом исследовании, чтобы контролировать концентрацию серина. Целью данного исследования является сделать этот метод удобно и обеспечить различные инструменты для нормализации и анализа данных. Таким образом, количество инструментов были разработаны для анализа и интерпретации данных. FIVA (функциональный Information Viewer и Analyzer) предоставляет платформу для обработки информации, содержащейся в кластерах генов, имеющихПохожие паттерны экспрессии генов, а также для построения функциональных профилей 16. Прокурор другой программный пакет, который облегчает идентификацию предполагаемых функций и аннотации генов 17. Благодаря использованию методов кластеризации, раскрывают обеспечивает ДНК-связывающего алгоритм обнаружения сайт. СНГ -regulatory мотивы генов может быть проецируются с помощью этого алгоритма 18. Genome2D предлагает для Windows-платформы для визуализации и анализа данных транскриптом, предлагая различные цветовые диапазоны для характеристики изменений в уровнях экспрессии генов на карту генома 19. Перец веб-сервер предлагает, в дополнение к методу все-в-одном анализе, набор инструментов для добычи для регулоны, промоутеров и связывающий фактор транскрипции сайтов 20. Полное аннотации межгенных в бактериальный геном может быть достигнуто с помощью этого пакета. Биологи могут извлечь большую пользу из перца, как это предлагает им платформу для разработки экспериментс тем чтобы гипотетический информация может быть подтвержден в пробирке 20. Эти программные пакеты вносят существенный вклад в анализ микрочипов, поскольку большинство из них находятся в свободном доступе и сделать нормализация и анализ данных очень надежным.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опишем протокол удобный, которые могут быть применены, чтобы выполнить всю транскриптом анализ бактерий. Ключевым моментом об этом конкретном методе является то, что условие, при котором собирают клетки будет меняться. После сбора клеток и выделение РНК, эта методика становится равным…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Анну де Йонг и Сигер Holsappel за помощь в ДНК-микрочипов производства слайдов. Поддержка Энн де Йонг для анализа биоинформатики также оценены. Мы также благодарим Йелле Slager для рассмотрения этого документа. Мухаммад Афзал и Ирфан Мансур поддерживаются GC университета, Файсалабаде, Пакистан в рамках программы развития факультета ГЭЦ Пакистане.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
