Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
La expresión génica y su regulación son muy importantes para entender el comportamiento de las células en diferentes condiciones. Varias técnicas se utilizan hoy en día para estudiar la expresión génica, pero la mayoría están limitados en términos de proporcionar una visión global de la expresión de todo el transcriptoma. Microarrays de ADN ofrecer una tecnología de investigación rápida y económica, lo que da una visión completa de la expresión génica global y tienen un gran número de aplicaciones, incluyendo la identificación de nuevos genes y factores de transcripción sitios, la caracterización de la actividad transcripcional de las células y también vinculantes ayudar en el análisis de miles de los genes (en un solo experimento). En el presente estudio, las condiciones para el análisis del transcriptoma bacteriana de cosecha de células para el análisis de microarrays de ADN han sido optimizados. Teniendo en cuenta el tiempo, los costos y la precisión de los experimentos, esta plataforma tecnológica resulta ser muy útil y universalmente applicabale para estudiar transcripto bacterianames. Aquí, realizamos el análisis de microarrays de ADN con Streptococcus pneumoniae como un caso-estudio comparando las respuestas transcripcional de S. pneumoniae cultiva en presencia de diferentes concentraciones de L-serina en el medio. El ARN total se aisló utilizando un método de Macaloide utilizando un kit de aislamiento de ARN y la calidad del ARN se comprobó mediante el uso de un kit de comprobación de la calidad del ARN. Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y las muestras de ADNc se marcaron utilizando uno de los dos colorantes fluorescentes de amina reactiva. Hechas en casa de ADN de microarrays diapositivas fueron utilizados para la hibridación de las muestras de ADNc marcadas y los datos de microarrays se analizaron mediante el uso de un marco de pre-procesamiento de datos de microarrays de cDNA (Microprep). Finalmente, Cyber-T se utilizó para analizar los datos generados usando Microprep para la identificación de estadísticamente significativas genes expresados diferencialmente. Paquetes de software Además, construido en la casa (pimienta, FIVA, DIVULGAR, FISCAL, Genome2D) se utilizaron para analizardatos.
Introduction
El estudio de todo el conjunto de la abundancia de ARNm (transcriptoma) codificada por el genoma de un organismo unicelular o una célula eucariota en un momento específico o bajo una condición específica, incluyendo la sobreexpresión del gen o knock-out, se llama transcriptómica. Transcriptómica nos permite observar hasta qué punto los genes se expresan bajo una condición particular en un punto X tiempo y nos da información acerca de la fuerza con los genes se expresan con respecto a una referencia.
Un microarray es una matriz bidimensional sobre un sustrato sólido (por lo general un portaobjetos de vidrio o silicio de células de película delgada) que se puede utilizar para ensayar grandes cantidades de material biológico mediante cribado de alto rendimiento, y miniaturizado, el procesamiento de multiplexado y en paralelo y detección métodos. Microarrays vienen en varios tipos, incluyendo microarrays de ADN, microarrays de proteínas, péptidos, microarrays microarrays de tejidos, microarrays de anticuerpos, microarrays de celulares y otros. Un microarray de ADN esbásicamente un conjunto de manchas de ADN microscópicos fijado a una superficie sólida, generalmente de vidrio. Microarrays de ADN se utilizan para medir los niveles de expresión de un gen o un conjunto de genes simultáneamente o determinar el genotipo de múltiples regiones de un genoma 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de una sonda están presentes dentro de cada punto de ADN que representa una secuencia de ADN específica, también conocido como un reportero. Las moléculas de ARNm etiquetados de las muestras se denominan "objetivos". Los fluoróforos se utilizan para medir la hibridación sonda-diana y detección de blancos marcados con fluoróforo determina la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en el objetivo. Un experimento de microarrays puede lograr múltiples pruebas genéticas en paralelo debido a una matriz puede contener decenas de miles de sondas. El diseño de un sencillo experimento de microarrays se muestra en la Figura 1. Recientemente, se estableció en nuestro y otros laboratorios que estas matrices son reutilizables, lo que hace que esta técnica bastante costo-effective.
Diferentes técnicas de aislamiento y purificación de ARN se han desarrollado a lo largo de los años, incluyendo C-TAB, SDS y métodos GT 4-8. Además, varios kits comerciales están también disponibles. Para la expresión de genes de ARN de alta calidad es muy importante. Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN se modifican para obtener una cantidad máxima de ARN. Del mismo modo, se reducen al mínimo los pasos para la preparación de cDNA y etiquetado de cDNA. La normalización de los datos después de la exploración también se lleva a cabo de manera eficiente mediante el uso de en-casa construida paquetes y herramientas de software 9.
Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano Gram-positivas que coloniza la nasofaringe y es la causa de múltiples infecciones, como la neumonía, sepsis, otitis media y meningitis 10. La bacteria puede utilizar una amplia variedad de los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia 11,12. Un número de estudios han llevado a cabo en elel metabolismo del nitrógeno neumocócica y la regulación destacando la importancia de los aminoácidos y su papel en la virulencia 13,14. En este estudio, la respuesta transcriptómica de S. pneumoniae a la evolución de las concentraciones de L-serina, un ácido muy presentes en el plasma sanguíneo humano amino, se reportó el uso de microarrays de ADN. La respuesta transcriptómica de S. pneumoniae crecido en una concentración mínima de L-serina (150 mM) se comparó con la crecido en una concentración máxima (10 mM) de la serina. Se utilizó medio químicamente definido (CDM o medio mínimo) 15 para este estudio para controlar la concentración de serina. El objetivo de este estudio es hacer que esta técnica fácil de usar y proporcionar diferentes herramientas para la normalización y el análisis de datos. Por lo tanto, se han desarrollado una serie de herramientas para el análisis e interpretación de datos. FIVA (Funcional Information Viewer y Analyzer) proporciona una plataforma para procesamiento de la información contenida en grupos de genes que tienenlos patrones de expresión de genes similares y para la construcción de perfiles funcionales 16. FISCAL es otro paquete de software que facilita la identificación de las funciones y las anotaciones de genes putativos 17. Al hacer uso de métodos de agrupamiento, DIVULGAR proporciona un algoritmo de detección de ADN sitio de unión. Motivos Cis-regulador de los genes pueden proyectarse utilizando este algoritmo 18. Genome2D ofrece una plataforma basada en Windows para la visualización y análisis de datos transcriptoma ofreciendo gamas de colores diferentes para caracterizar los cambios en los niveles de expresión de genes en un mapa del genoma 19. El servidor web pimienta ofrece, además del método todo-en-un análisis, una caja de herramientas para la minería para regulons, promotores y de unión al factor de transcripción sitios de 20. Anotación completa de las regiones intergénicas en un genoma bacteriano se puede lograr mediante el uso de este paquete. Los biólogos pueden beneficiarse enormemente de pimienta, ya que les ofrece una plataforma para el diseño de experimentos para que la información hipótesis puede confirmarse in vitro 20. Estos paquetes de software contribuyen significativamente a la análisis de microarrays ya que la mayoría de ellos son libremente disponible y crea la normalización de datos y análisis muy fiable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un protocolo fácil de usar que puede ser aplicado para realizar el análisis del transcriptoma enteras de bacterias. El punto clave de esta técnica en particular es que las condiciones en que se cosechan las células variará. Después de cosechar las células y el aislamiento de ARN, esta técnica se hace igual para todos los tipos de muestras bacterianas y sigue los pasos exactamente idénticos y por lo tanto, se puede aplicar a cualquier tipo de cultivo bacteriano. El protocolo es muy simple y convenien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Anne de Jong y Siger Holsappel para obtener ayuda con la producción de diapositivas microarrays de ADN. El apoyo de Anne de Jong para el análisis de la bioinformática también se agradece. También agradecemos a Jelle Slager para revisar el documento. Muhammad Afzal y Irfan Manzoor son apoyados por la Universidad GC, Faisalabad, Pakistán bajo el programa de desarrollo de la facultad de HEC Pakistán.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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