Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Genexpression und ihre Regulation sind sehr wichtig, um das Verhalten von Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen. Verschiedene Techniken werden heute verwendet werden, um Genexpression zu untersuchen, aber die meisten sind in Bezug auf die Bereitstellung einen allgemeinen Überblick über die Expression des gesamten Transkriptoms begrenzt. DNA-Microarrays bieten eine schnelle und Wirtschaftsforschung-Technologie, die einen vollständigen Überblick über globale Genexpression gibt und haben eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Identifizierung neuer Gene und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Charakterisierung der Transkriptionsaktivität der Zellen und auch dazu beitragen, bei der Analyse von tausenden von Genen (in einem einzigen Experiment). In der vorliegenden Studie, die Bedingungen für bakterielle Transkriptomanalyse von Zellernte auf DNA-Microarray-Analyse optimiert. Unter Berücksichtigung der Zeit, Kosten und Genauigkeit der Experimente, erweist sich diese Technologie-Plattform als sehr nützlich und universell applicabale zur Untersuchung bakterieller transcriptomes. Hier führen wir DNA-Microarray-Analyse mit Streptococcus pneumoniae als Fallstudie durch Vergleich der Transkriptionsreaktionen S. pneumoniae in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von L-Serin in dem Medium gezüchtet. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Macaloid Verfahren unter Verwendung eines RNA-Extraktions-Kit und die Qualität der RNA isoliert wurde unter Verwendung eines RNA-Qualitätskontrollsatz geprüft. cDNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt, und die cDNA-Proben wurden unter Verwendung eines von zwei Amin-reaktive Farbstoff trägt. Selbst gemachte DNA Microarray-Slides wurden für die Hybridisierung der markierten cDNA-Proben und Mikroarray-Daten verwendet wurden unter Verwendung eines cDNA-Mikro Datenvorverarbeitung Rahmen (Microprep) analysiert. Schließlich Cyber-T verwendet wurde, um die erzeugten Verwendung Microprep zur Identifizierung statistisch signifikant unterschiedlich exprimierten Genen Daten zu analysieren. Außerdem im Haus eingebaute Software-Pakete (Pfeffer, FIVA, offenbaren, Staatsanwalt, Genome2D) wurden verwendet, um zu analysierenDaten.
Introduction
Die Untersuchung der Gesamtheit der mRNA-Häufigkeit (Transkriptom) von dem Genom eines einzelligen Organismus oder einer eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter einer bestimmten Bedingung codiert, einschließlich Gen-Überexpression oder Knock-out wird Transkriptomik bezeichnet. Transcriptomics ermöglicht es uns, in welchem Umfang Gene werden unter einer bestimmten Bedingung zu einem Zeitpunkt X ausgedrückt beobachten und gibt uns Informationen darüber, wie stark die Gene in Bezug auf einen Referenz ausgedrückt.
Ein Mikroarray ist ein zweidimensionales Array auf einem festen Substrat (in der Regel ein Glasobjektträger oder Silizium-Dünnschichtzelle), die verwendet werden kann, um große Mengen an biologischem Material Assay unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening, und miniaturisierte, gemultiplext und parallele Verarbeitung und Detektion Methoden. Microarrays sind in verschiedenen Typen, einschließlich DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, Peptidchips, Tissue Microarrays, Antikörper-Mikroarrays, Zellmikroarrays und andere. Ein DNA-Microarray istim Grunde eine Anordnung von mikroskopischen DNA-Spots an eine feste Oberfläche, üblicherweise Glas fixiert. DNA-Mikroarrays verwendet, um die Expression von einem Gen oder einer Reihe von Genen gleichzeitig zu messen oder mehrere Regionen eines Genoms 2,3 genotypisieren. Picomol (10 -12 mol) einer Sonde innerhalb der einzelnen DNA Stelle, die eine bestimmte DNA-Sequenz, die auch als Reporter bekannt repräsentiert vorhanden. Die markierten mRNA-Moleküle aus den Proben werden "Ziele" bezeichnet. Fluorophore verwendet werden, um Sonden-Target-Hybridisierung und Detektion von Fluorophor-markierte Targets zur Messung bestimmt die relative Häufigkeit von Nukleinsäuresequenzen in dem Ziel. Ein Mikroarray kann mehrere genetische Tests parallel zu erreichen, weil eine Anordnung kann Zehntausende von Sonden enthalten. Der Aufbau eines einfachen Mikroarray wird in Abbildung 1 gezeigt. Kürzlich konnte in unseren Laboren und anderen festgestellt, daß sich diese Anordnungen sind wiederverwendbar, die diese Technik sehr kostengünstig macht Wirksame.
8 – verschiedene RNA-Isolierung und Reinigungsverfahren sind im Laufe der Jahre, einschließlich C-TAB, SDS und GT Methoden 4 entwickelt. Darüber hinaus sind auch mehrere kommerzielle Kits zur Verfügung. Für Genexpression qualitativ hochwertige RNA ist sehr wichtig. Daher werden die RNA-Isolationsverfahren modifiziert, um eine maximale Menge an RNA zu erhalten. In ähnlicher Weise werden die Schritte für die cDNA Herstellung und Kennzeichnung von cDNA minimiert. Die Normalisierung der Daten nach dem Scanvorgang wird auch effizient durch die Verwendung in-Haus gebaut Softwarepakete und Tools 9 durchgeführt.
Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positiven menschlichen Erreger der Nasenrachenraum besiedelt und ist die Ursache für mehrere Infektionen wie Lungenentzündung, Sepsis, Mittelohrentzündung und Meningitis 10. Das Bakterium kann eine Vielzahl der für das Wachstum und Überleben 11,12 erforderlichen Nährstoffe zu nutzen. Eine Reihe von Untersuchungen wurden an das mitgeführtePneumokokken-Stickstoff-Stoffwechsel und Regulation die Bedeutung der Aminosäuren und ihre Rolle in der Virulenz 13,14. In dieser Studie wurde die transkriptomischen Antwort S. pneumoniae an wechselnde Konzentrationen von L-Serin, einem Aminosäure reichlich im menschlichen Blutplasma vorhanden ist, wird berichtet, unter Verwendung von DNA-Mikroarrays. Das Transkriptom Antwort von S. pneumoniae in einer minimalen Konzentration von L-Serin (150 um) aufgewachsen wurde, daß sich eine maximale Konzentration (10 mM) von Serin gewachsen verglichen. Chemisch definierten Medium (CDM oder Minimalmedium) 15 wurde für diese Untersuchung verwendet, um die Konzentration von Serin zu steuern. Der Schwerpunkt dieser Studie ist es, diese Technik benutzerfreundlich zu machen und verschiedene Werkzeuge für die Datennormalisierung und Analysen. Daher wurden eine Reihe von Werkzeugen für die Analyse und die Interpretation der Daten entwickelt. FIVA (Functional Information Viewer und Analyzer) bietet eine Plattform für die Verarbeitung von Informationen in Gruppen von Genen enthalten habenähnliches Genexpressionsmuster und zum Konstruieren Funktionsprofile 16. STAATSANWALT ist ein weiteres Softwarepaket, das die Identifizierung der mutmaßlichen Funktionen und Annotationen der Gene 17 erleichtert. Durch die Verwendung von Clusterverfahren, offenbaren eine DNA-Bindungsstelle-Erkennungsalgorithmus. Cis: Rechts Motive der Gene kann durch Verwendung dieses Algorithmus 18 projiziert werden. Genome2D bietet eine Windows-basierte Plattform für die Visualisierung und Analyse von Transkriptom-Daten, indem sie verschiedene Farbpaletten, um die Veränderungen in der Genexpression Ebenen auf einem Genomkarte 19 zu charakterisieren. Der Pfeffer Webserver bietet, zusätzlich zu den all-in-one-Analyseverfahren, einem Werkzeugkasten für den Bergbau für Regulons, Promotoren und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 20. Voll Annotation von intergenischen Regionen in einem bakteriellen Genom kann mit diesem Paket erzielt werden. Biologen können stark von Pfeffer profitieren, da sie bietet ihnen eine Plattform für die Entwicklung Experiments, so dass der hypothetische Informationen können in vitro 20 bestätigt werden. Diese Softwarepakete tragen wesentlich zur Microarray-Analyse, wie die meisten von ihnen sind frei verfügbar und machen die Datennormalisierung und Analyse sehr zuverlässig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine benutzerfreundliche Protokoll, angewendet werden können, um ganze Transkriptomanalyse von Bakterien durchzuführen. Der entscheidende Punkt dieser besonderen Technik ist, dass die Bedingungen, unter denen die Zellen geerntet variieren. Nach der Ernte der Zellen und RNA-Isolation, wird diese Technik gleich für alle Arten von Bakterienproben und folgt genau identische Schritte, und daher kann auf jede Art von Bakterienkulturen angewendet werden. Das Protokoll ist sehr einfach und bequem und beginnt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Anne de Jong und Siger Holsappel für die Hilfe bei der DNA-Microarrays Schiebe Produktion. Unterstützung Anne de Jong für bioinformatische Analyse wird auch geschätzt. Wir danken auch Jelle Slager zur Überprüfung des Papiers. Muhammad Afzal und Irfan Manzoor werden von der GC-Universität, Faisalabad, Pakistan unter der Fakultätsentwicklungsprogramms der HEC Pakistan unterstützt.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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