Un pipeline rapide et fiable pour l'étude de cas analyse bactérienne transcriptome: Serine dépendant régulation des gènes dans<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
L'expression des gènes et son règlement sont très importantes pour comprendre le comportement des cellules dans des conditions différentes. Diverses techniques sont utilisées de nos jours pour étudier l'expression des gènes, mais la plupart sont limités en termes de fournir une vue d'ensemble de l'expression de l'ensemble du transcriptome. Les puces à ADN offrir une technologie de recherche rapide et économique, qui donne un aperçu complet de l'expression globale des gènes et avoir un grand nombre d'applications, y compris l'identification de nouveaux gènes et facteur de transcription sites, la caractérisation de l'activité transcriptionnelle des cellules et lient également aider à analyser des milliers des gènes (en une seule expérience). Dans la présente étude, les conditions pour bactérienne analyse du transcriptome de la récolte de cellules à l'analyse des microréseaux d'ADN ont été optimisés. Prenant en compte le temps, les coûts et la précision des expériences, cette plate-forme de la technologie se avère très utile et universellement applicabale pour étudier transcripto bactériennemes. Ici, nous effectuons l'analyse des microréseaux d'ADN avec Streptococcus pneumoniae comme une étude de cas en comparant les réponses de la transcription de S. pneumoniae cultivées en présence de concentrations de L-sérine dans le milieu variable. L'ARN total a été isolé en utilisant un procédé Macaloid en utilisant un kit d'isolement d'ARN et la qualité de l'ARN a été vérifiée en utilisant un kit RNA de contrôle de la qualité. L'ADNc a été préparé en utilisant la transcriptase inverse et les échantillons d'ADNc ont été marquées avec l'une des deux colorants fluorescents réactifs avec les amines. Diapositives de microréseaux d'ADN maison ont été utilisés pour l'hybridation des échantillons d'ADNc marqués et les données de puces à ADN ont été analysés en utilisant un cadre de données des puces à ADN de pré-traitement (Microprep). Enfin, Cyber-T a été utilisé pour analyser les données générées à l'aide Microprep pour l'identification de gènes différentiellement exprimés statistiquement significatives. Progiciels outre, construits en interne (poivre, FIVA, divulguer, PROCUREUR, Genome2D) ont été utilisés pour analyserdonnées.
Introduction
L'étude de l'ensemble des ARNm abondance (transcriptome) codée par le génome d'un organisme unicellulaire ou une cellule eucaryote à un moment précis ou dans des conditions spécifiques, y compris la surexpression du gène ou knock-out, est appelé transcriptomique. Transcriptomique nous permet d'observer dans quelle mesure les gènes sont exprimés sous une condition particulière à un instant X et nous donne des informations sur la façon fortement les gènes sont exprimés par rapport à une référence.
Une puce à ADN est une matrice bidimensionnelle sur un substrat solide (généralement une lame de verre ou de silicium cellule à couche mince) qui peut être utilisé pour doser des quantités importantes de matière biologique en utilisant un criblage à haut débit, et miniaturisé, le traitement en multiplex et parallèle et la détection méthodes. Microarrays viennent en différents types, y compris ADN puces, des puces à protéines, puces peptidiques, puces tissulaires, microarrays d'anticorps, puces cellulaires et autres. Une puce à ADN estessentiellement un ensemble de taches microscopiques d'ADN fixé à une surface solide, généralement en verre. Les puces à ADN sont utilisés pour mesurer les niveaux d'expression d'un gène ou d'un ensemble de gènes simultanément ou au génotype plusieurs régions du génome 2,3. Picomoles (10 -12 mole) d'une sonde sont présents au sein de chaque point d'ADN qui représente une séquence d'ADN spécifique, aussi connu comme un journaliste. Les molécules d'ARNm étiquetés à partir des échantillons sont appelés «cibles». Les fluorophores sont utilisés pour mesurer l'hybridation sonde-cible et la détection de cibles marqué par un fluorophore détermine l'abondance relative des séquences d'acide nucléique dans la cible. Une expérience de puces à ADN peut accomplir des tests génétiques multiples en parallèle, car un tableau peut contenir des dizaines de milliers de sondes. La disposition d'une expérience de puces à ADN simple est illustrée à la figure 1. Récemment, il a été établi dans nos laboratoires et d'autres que ces tableaux sont réutilisables, ce qui rend cette technique très coût-effective.
Des techniques d'isolement et de purification d'ARN différents ont été développés au cours des années, y compris C-TAB, SDS et méthodes GT 4-8. En outre, plusieurs kits commerciaux sont également disponibles. Pour l'expression des gènes de l'ARN de haute qualité est très importante. Par conséquent, les procédés d'isolement de l'ARN sont modifiés pour obtenir une quantité maximale de l'ARN. De même, les étapes de préparation d'ADNc et l'étiquetage des ADNc sont minimisés. Normalisation des données après la numérisation est également effectuée efficacement en utilisant maison-intégré paquets et des outils logiciels neuf.
Streptococcus pneumoniae est un agent pathogène humain à Gram positif qui colonise le nasopharynx et est la cause de multiples infections telles que la pneumonie, la septicémie, l'otite moyenne et la méningite 10. La bactérie peut utiliser une grande variété de nutriments nécessaires à la croissance et à la survie 11,12. Un certain nombre d'études ont été menées sur lamétabolisme de l'azote à pneumocoques et la réglementation en soulignant l'importance des acides aminés et de leur rôle dans la virulence 13,14. Dans cette étude, la réponse transcriptomique de S. pneumoniae à l'évolution des concentrations de L-sérine, un acide aminé abondamment présent dans le plasma de sang humain, est présenté en utilisant des puces à ADN. La réponse transcriptomique de S. pneumoniae cultivées dans une concentration minimale de L-sérine (150 uM) a été comparée à celle développée dans une concentration maximale (10 mM) de serine. Milieu défini chimiquement (MDP ou milieu minimal) 15 a été utilisé pour cette étude pour contrôler la concentration de la sérine. L'objectif de cette étude est de rendre cette technique convivial et pour fournir différents outils pour la normalisation et l'analyse des données. Par conséquent, un certain nombre d'outils ont été développés pour l'analyse et l'interprétation des données. FIVA (fonctionnelle Information Viewer et Analyzer) fournit une plate-forme pour traitement de l'information contenue dans des groupes de gènes ayantprofils d'expression des gènes semblables et pour la construction de profils fonctionnels 16. PROCUREUR est un autre logiciel qui facilite l'identification des fonctions putatives et annotations de gènes 17. En faisant usage de méthodes de classification, COMMUNIQUER fournit un algorithme de détection de liaison du site de l'ADN. Cis de les motifs de gènes peuvent être projetées en utilisant cet algorithme 18. Genome2D offre une plate-forme Windows pour la visualisation et l'analyse des données du transcriptome en offrant différentes gammes de couleurs pour caractériser les changements dans les niveaux d'expression des gènes sur une carte du génome 19. Le serveur Web de Pepper propose, en plus de la méthode tout-en-une analyse, une boîte à outils pour l'exploitation minière pour les régulons, promoteurs et de liaison du facteur de transcription 20 sites. Annotation complet de régions intergéniques dans un génome bactérien peut être obtenu en utilisant ce paquet. Les biologistes peuvent grandement bénéficier de poivre car il leur offre une plate-forme pour la conception de l'expériences afin que les informations hypothétique peut être confirmée in vitro 20. Ces logiciels contribuent de manière significative à l'analyse des microréseaux comme la plupart d'entre eux sont librement disponibles et font la normalisation et l'analyse des données très fiable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons un protocole conviviale qui peut être appliquée pour effectuer l'analyse de transcriptome total de bactéries. Le point clé de cette technique particulière, ce est que la condition dans laquelle les cellules sont récoltées varie. Après la récolte des cellules et isolement de l'ARN, cette technique devient égale pour tous les types d'échantillons bactériens et suit les étapes exactement identiques et, par conséquent, peut être appliquée à tout type de culture bactérienne. Le p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Anne de Jong et Siger Holsappel de l'aide à la production de puces à ADN de diapositive. Le soutien d'Anne de Jong pour l'analyse bioinformatique est également apprécié. Nous remercions également Jelle Slager d'examiner le document. Muhammad Afzal et Irfan Manzoor sont pris en charge par l'Université GC, Faisalabad, Pakistan, sous le programme de développement du corps professoral d'HEC Pakistan.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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