बैक्टीरियल transcriptome विश्लेषण प्रकरण अध्ययन के लिए एक तेज और विश्वसनीय पाइपलाइन: सेरीन निर्भर जीन विनियमन में<em> स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
जीन अभिव्यक्ति और उसके विनियमन अलग अलग परिस्थितियों में कोशिकाओं के व्यवहार को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न तकनीकों जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए आजकल इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन सबसे पूरे transcriptome की अभिव्यक्ति का एक समग्र तस्वीर को उपलब्ध कराने के संदर्भ में सीमित कर रहे हैं। डीएनए वैश्विक जीन अभिव्यक्ति की एक पूरी सिंहावलोकन देता है जो एक तेजी से और आर्थिक अनुसंधान प्रौद्योगिकी, प्रदान करते हैं और हजारों का विश्लेषण करने में मदद भी साइटों, कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के लक्षण वर्णन और बाध्यकारी उपन्यास जीन और प्रतिलेखन कारक की पहचान सहित अनुप्रयोगों का एक विशाल संख्या है जीन की (एक ही प्रयोग में)। वर्तमान अध्ययन में, डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए सेल फसल से बैक्टीरियल transcriptome विश्लेषण के लिए शर्तों को अनुकूलित किया गया है। खाते में समय, लागत और प्रयोगों की सटीकता ले रहा है, इस प्रौद्योगिकी मंच बैक्टीरियल transcripto के अध्ययन के लिए बहुत ही उपयोगी और सार्वभौमिक applicabale होना साबित करता हैएमईएस। यहाँ, हम एस के ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं की तुलना द्वारा एक मामले के अध्ययन के रूप में स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के साथ डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण प्रदर्शन निमोनिया माध्यम में एल सेरीन सांद्रता बदलती की मौजूदगी में हो। कुल शाही सेना के एक शाही सेना गुणवत्ता की जांच किट का उपयोग करके जाँच की थी एक शाही सेना अलगाव किट और शाही सेना की गुणवत्ता का उपयोग कर एक Macaloid विधि का उपयोग कर अलग किया गया था। सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर तैयार किया गया था और सीडीएनए नमूने दो एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंगों में से एक का उपयोग कर लेबल थे। घर का डीएनए माइक्रोएरे स्लाइड एक सीडीएनए माइक्रोएरे डेटा पूर्व प्रसंस्करण फ्रेमवर्क (Microprep) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया लेबल किया सीडीएनए नमूने और माइक्रोएरे डेटा के संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया। अंत में, साइबर टी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण विभिन्न व्यक्त जीनों की पहचान के लिए Microprep का उपयोग कर उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, घर में निर्मित सॉफ्टवेयर पैकेज (काली मिर्च, FIVA का खुलासा, अभियोजक, Genome2D) का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गयाडेटा।
Introduction
जीन overexpression या नाक आउट सहित, एक विशिष्ट समय में या एक विशिष्ट शर्त के तहत एक कोशिकीय जीव या एक यूकेरियोटिक सेल के जीनोम द्वारा इनकोडिंग mRNA के बहुतायत (transcriptome) के पूरे सेट का अध्ययन, transcriptomics कहा जाता है। Transcriptomics हमें हद तक जीन एक समय बिंदु एक्स पर एक विशेष शर्त के तहत व्यक्त कर रहे हैं कि क्या करने के लिए निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है और हमें जीन एक संदर्भ के सापेक्ष व्यक्त कर रहे हैं कि कैसे दृढ़ता के बारे में जानकारी देता है।
एक माइक्रोएरे एक ठोस सब्सट्रेट पर एक दो आयामी सरणी (आमतौर पर एक गिलास स्लाइड या सिलिकॉन पतली फिल्म सेल) उच्च throughput स्क्रीनिंग का उपयोग कर जैविक सामग्री की एक बड़ी मात्रा परख के लिए इस्तेमाल किया, और छोटी किया जा सकता है, मल्टिप्लेक्स और समानांतर प्रसंस्करण और पहचान है तरीकों। डीएनए-प्रोटीन, प्रोटीन, पेप्टाइड प्रोटीन, ऊतक, एंटीबॉडी, सेलुलर प्रोटीन और अन्य लोगों सहित विभिन्न प्रकार में आते हैं। एक डीएनए माइक्रोएरे हैमूल रूप से सूक्ष्म डीएनए स्थलों में से एक विधानसभा एक ठोस सतह, आमतौर पर कांच के लिए तय की। डीएनए एक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर या एक साथ जीनों का एक सेट को मापने के लिए या एक जीनोम 2,3 के कई क्षेत्रों जीनोटाइप के लिए उपयोग किया जाता है। एक जांच के picomoles (10 -12 मोल) भी एक पत्रकार के रूप में जाना जाता है एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रत्येक डीएनए स्थान के भीतर मौजूद हैं। नमूनों से लेबल किया mRNA के अणुओं 'लक्ष्य' कहा जाता है। Fluorophores जांच-लक्ष्य संकरण और फ्लोरोफोरे लेबल लक्ष्य का पता लगाने के उपाय करने के लिए उपयोग किया जाता है लक्ष्य में न्यूक्लिक एसिड दृश्यों के रिश्तेदार बहुतायत निर्धारित करता है। एक सरणी दसियों जांच के हजारों की हो सकती है क्योंकि एक माइक्रोएरे प्रयोग समानांतर में कई आनुवंशिक परीक्षण पूरा कर सकते हैं। एक साधारण माइक्रोएरे प्रयोग के लेआउट चित्र 1 में दिखाया गया है। हाल ही में, यह इन सरणियों इस तकनीक काफी लागत प्रभावी ढंग से है, जो पुन: प्रयोज्य हैं कि हमारे और अन्य प्रयोगशालाओं में स्थापित किया गया थाई।
8 – अलग शाही सेना अलगाव और शोधन तकनीक सी-टैब, एसडीएस और जी.टी. विधियों 4 सहित वर्षों में विकसित किया गया है। इसके अलावा, कई वाणिज्यिक किट भी उपलब्ध हैं। जीन अभिव्यक्ति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, आरएनए अलगाव विधियों शाही सेना की अधिकतम मात्रा प्राप्त करने के लिए संशोधित कर रहे हैं। इसी तरह, सीडीएनए की सीडीएनए तैयारी और लेबलिंग के लिए चरणों को कम से कम कर रहे हैं। स्कैनिंग के बाद डेटा को सामान्य बनाने के भी घर में निर्मित सॉफ्टवेयर संकुल और उपकरणों के 9 का उपयोग करके कुशलता से किया जाता है।
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया nasopharynx colonizes और ऐसे निमोनिया, पूति, ओटिटिस मीडिया के रूप में कई के संक्रमण के कारण होता है और 10 मैनिंजाइटिस कि एक ग्राम पॉजिटिव मानव रोगजनक है। जीवाणु विकास और अस्तित्व 11,12 के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की एक विस्तृत विविधता का उपयोग कर सकते हैं। अध्ययन का एक नंबर पर बाहर किया गया हैअमीनो एसिड के महत्व और डाह 13,14 में उनकी भूमिका पर बल न्यूमोकोकल नाइट्रोजन चयापचय और विनियमन। इस अध्ययन में, एस के transcriptomic प्रतिक्रिया निमोनिया एल सेरीन, मानव रक्त प्लाज्मा में बहुतायत से मौजूद एक एमिनो एसिड की सांद्रता बदलने के लिए डीएनए का उपयोग कर सूचना दी है। एस के transcriptomic प्रतिक्रिया एल सेरीन (150 माइक्रोन) की एक न्यूनतम एकाग्रता में उगाई निमोनिया एक अधिकतम एकाग्रता सेरीन का (10 मिमी) में उगाया जाता है कि की तुलना में था। रासायनिक परिभाषित मध्यम (सीडीएम या कम से कम मध्यम) 15 सेरीन की एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन का ध्यान इस तकनीक उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने के लिए और डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण के लिए विभिन्न उपकरण उपलब्ध कराने के लिए है। इसलिए, उपकरणों की एक संख्या विश्लेषण और डेटा व्याख्या के लिए विकसित किए गए। FIVA (कार्यात्मक सूचना दर्शक और विश्लेषक) होने के जीन के समूहों में निहित प्रसंस्करण जानकारी के लिए एक मंच प्रदान करता हैइसी तरह के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और कार्यात्मक प्रोफाइल को 16 के निर्माण के लिए। अभियोजक ख्यात कार्यों और जीन 17 का एनोटेशन की पहचान की सुविधा है कि एक और सॉफ्टवेयर पैकेज है। क्लस्टरिंग विधियों का उपयोग करके खुलासा एक डीएनए बाध्यकारी साइट का पता लगाने एल्गोरिथ्म प्रदान करता है। जीनों का सीआईएस -regulatory रूपांकनों इस एल्गोरिथ्म 18 का उपयोग करके पेश किया जा सकता है। Genome2D एक जीनोम मानचित्र पर 19 जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन चिह्नित करने के लिए अलग अलग रंग पर्वतमाला की पेशकश के द्वारा दृश्य और transcriptome डेटा के विश्लेषण के लिए एक Windows आधारित मंच प्रदान करता है। काली मिर्च वेबसर्वर सभी में एक विश्लेषण विधि, regulons, प्रमोटरों और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों 20 के लिए खनन के लिए एक उपकरण बॉक्स के अलावा, प्रदान करता है। एक जीवाणु जीनोम में intergenic क्षेत्रों का पूरा एनोटेशन इस पैकेज का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रयोग डिजाइनिंग के लिए उन्हें एक मंच प्रदान करता है के रूप में जीव बहुत काली मिर्च से फायदा हो सकता हैएस इतना है कि धारणा जानकारी विट्रो 20 में पुष्टि की जा सकती है। उनमें से ज्यादातर आसानी से उपलब्ध हैं और डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण बहुत विश्वसनीय बनाने के रूप में इन सॉफ्टवेयर संकुल माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए काफी योगदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम बैक्टीरिया के पूरे transcriptome विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस विशेष तकनीक के बारे में प्रमुख मुद्दा कोशिकाओं काटा जाता है, जिसके तहत हालत भि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीएनए स्लाइड उत्पादन के साथ मदद के लिए ऐनी डी जोंग और Siger Holsappel धन्यवाद। जैव सूचना विज्ञान के विश्लेषण के लिए ऐनी डी जोंग का समर्थन भी सराहना की है। हम भी कागज की समीक्षा करने के लिए Jelle Slager धन्यवाद। मुहम्मद अफजल और इरफान मंजूर एचईसी पाकिस्तान के संकाय विकास कार्यक्रम के तहत जीसी विश्वविद्यालय, फैसलाबाद, पाकिस्तान द्वारा समर्थित हैं।
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
