En snabb och pålitlig Pipeline för Bacterial transkriptomanalys Fallstudie: Serin beroende genreglering i<em> Streptococcus pneumoniae</em
Summary
This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Abstract
Genuttryck och dess reglering är mycket viktigt att förstå beteendet hos celler under olika förhållanden. Olika tekniker används idag för att studera genuttryck, men de flesta är begränsade när det gäller att ge en samlad bild av uttrycket av hela transkriptom. DNA microarrays erbjuder en snabb och ekonomisk forskning teknik, som ger en fullständig översikt över den globala genuttryck och har ett stort antal tillämpningar inklusive identifiering av nya gener och transkriptionsfaktor bindningsställen, karakterisering av transkriptionsaktiviteten hos cellerna och även hjälpa till att analysera tusentals av gener (i ett enda experiment). I den aktuella studien har förutsättningarna för bakteriell transkriptomanalys från cell skörd till DNA microarray analys optimerats. Med hänsyn till den tid, kostnader och noggrannhet av experimenten, bevisar detta teknikplattform för att vara mycket användbart och universellt applicabale för att studera bakterie transcriptomes. Här utför vi DNA microarray analys med Streptococcus pneumoniae som en fallstudie genom att jämföra transkription svaren från S. pneumoniae odlades i närvaro av varierande L-serin koncentrationer i mediet. Total-RNA isolerades genom användning av en Macaloid metod med användning av ett RNA isoleringskit och kvaliteten hos RNA kontrollerades genom användning av en kontroll RNA kvalitet kit. cDNA framställdes med användning av omvänt transkriptas och de cDNA-proven märktes med användning av en av två amin-reaktiva fluorescerande färgämnen. Made DNA microarray slides användes för hybridisering av de märkta cDNA-prover och microarray data analyserades genom användning av en ram-cDNA microarray data som pre-processing (Microprep). Slutligen Cyber-T används för att analysera de data som genereras med hjälp Microprep för identifiering av statistiskt signifikanta differentiellt uttryckta gener. Vidare internt byggda programpaket (peppar, FIVA, avslöja, åklagare, Genome2D) användes för att analyseradata.
Introduction
Studiet av hela uppsättningen av mRNA överflöd (transkriptom) kodas av genomet hos en encellig organism eller en eukaryot cell vid en viss tidpunkt eller under ett särskilt villkor, inklusive gen överuttryck eller knock-out, kallas transkriptomik. Transkriptomik tillåter oss att observera i vilken utsträckning gener uttrycks enligt ett visst tillstånd vid en tidpunkt X och ger oss information om hur starkt generna uttrycks i förhållande till en referens.
En microarray är en tvådimensionell array på ett fast substrat (vanligen ett objektglas eller kisel tunnfilmscell) som kan användas för att analysera stora mängder av biologiskt material med användning av high-throughput screening, och miniatyriserade, multiplexeras och parallell bearbetning och detektering metoder. Microarrays finns i olika typer, inklusive DNA-mikroarrayer, protein mikroarrayer, peptid mikroarrayer, vävnads mikroarrayer, mikroarrayer antikropps, cellulära mikroarrayer och andra. En DNA microarray äri grund och botten ett aggregat av mikroskopiska DNA fläckar fixerad till en fast yta, vanligen glas. DNA microarrays används för att mäta uttrycksnivåer av en gen eller en uppsättning gener samtidigt eller till genotyp flera regioner i en genomet 2,3. Picomol (10 -12 mol) av en sond finns inom varje DNA plats som representerar en specifik DNA-sekvens, även känd som en reporter. De märkta mRNA-molekyler från proverna kallas "mål". Fluoroforer används för att mäta sond-mål-hybridisering och detektion av fluoroformärkta mål bestämmer den relativa förekomsten av nukleinsyrasekvenser i målet. En microarray experiment kan åstadkomma flera genetiska test parallellt eftersom en array kan innehålla tiotusentals sonder. Layouten på ett enkelt microarray experiment visas i figur 1. Nyligen fastställdes det i våra och andra labb att dessa matriser är återanvändbara, vilket gör denna teknik helt kostnads effective.
Olika RNA isolerings- och reningstekniker har utvecklats under åren, inklusive C-TAB, SDS och GT metoder 4-8. Dessutom flera kommersiella kit finns också. För genuttryck högkvalitativt RNA är mycket viktigt. Därför är RNA isoleringsmetoder modifieras för att få en maximal mängd av RNA. På samma sätt är de steg för cDNA beredning och märkning av cDNA minimeras. Normalisering av data efter skanning utförs också effektivt genom att använda in-house byggda programpaket och verktyg 9.
Streptococcus pneumoniae är en Gram-positiv human patogen som koloniserar nasofarynx och är orsaken till flera infektioner såsom lunginflammation, sepsis, otitis media och meningit 10. Bakterien kan använda en mängd olika näringsämnen som behövs för tillväxt och överlevnad 11,12. Ett antal studier har utförts påpneumokock kvävemetabolism och reglering betona vikten av aminosyror och deras roll i virulens 13,14. I denna studie, den transcriptomic svaret av S. pneumoniae till förändrade koncentrationer av L-serin, en aminosyra högst närvarande i humant plasma blodet, rapporteras med användning av DNA-mikromatriser. Den transcriptomic respons S. pneumoniae odlades i en minsta koncentration av L-serin (150 pM) jämfördes med den som odlas i en maximal koncentration (10 mM) serin. Kemiskt definierat medium (CDM eller minimalt medium) 15 användes för denna studie för att reglera koncentrationen av serin. Fokus i denna studie är att göra denna teknik användarvänlig och tillhandahålla olika verktyg för data normalisering och analys. Därför har ett antal verktyg som utvecklats för analys och tolkning av data. FIVA (Functional Information Viewer och Analyzer) ger en plattform för att bearbeta information i kluster av gener som harliknande genexpressionsmönster och för att konstruera funktionella profiler 16. ÅKLAGARENS är ett annat programpaket som underlättar identifieringen av förmodade funktioner och anteckningar av gener 17. Genom att använda sig av klustermetoder, beskriver ger en DNA-bindningsställe detekteringsalgoritm. Cis den förfogar motiv av gener kan projiceras med hjälp av denna algoritm 18. Genome2D erbjuder en Windows-baserad plattform för visualisering och analys av transkriptom uppgifter genom att erbjuda olika färgskalor att karakterisera förändringar i genuttryck nivåer på en genom karta 19. Pepper webserver erbjuder, förutom allt-i-ett-analysmetod, en verktygslåda för gruvdrift för reguloner, initiativtagare och transkriptionsfaktor bindningsställen 20. Fullständig annotering av intergena regioner i en bakteriegenomet kan uppnås genom att använda detta paket. Biologer kan ha stor nytta av peppar, eftersom det ger dem en plattform för att utforma experimentets så att hypotes informationen kan bekräftas in vitro 20. Dessa programvarupaket bidrar väsentligt till microarray analys som de flesta av dem är fritt tillgängliga och göra data normalisering och analys mycket pålitlig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en användarvänlig protokoll som kan tillämpas för att utföra hela transkriptomanalys av bakterier. Den viktigaste punkten om denna speciella teknik är att se under vilka förutsättningar cellerna skördas varierar. Efter skörd av cellerna och RNA-isolering, blir denna teknik lika för alla typer av bakteriella prover och följer exakt identiska steg och därför, kan tillämpas på alla typer av bakteriekultur. Protokollet är mycket enkel och bekväm och startar från RNA-isolering. Vår RNA isoler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Anne de Jong och Siger Holsappel för hjälp med DNA microarrays glidproduktion. Anne de Jong stöd för bioinformatik analys är också uppskattat. Vi tackar också Jelle Slager för granskning papperet. Muhammad Afzal och Irfan Manzoor stöds av GC-universitetet, Faisalabad, Pakistan enligt fakultets utvecklingsprogram av HEC Pakistan.
Materials
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour’s fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use’s Guide and Tutorial. , (2005).
