Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l'expression des<em> Plasmodium</em> rhoptries Protéines
Summary
L'expression des protéines paludisme dans les systèmes à base de cellules reste difficile. Nous démontrons deux systèmes cellule libre expression étape et une IVT de l'étape (la traduction in vitro) pour exprimer des protéines recombinantes de rhoptries paludisme à partir de cellules HeLa. On utilise un système de purification par affinité à base de résine Ni-à purifier les protéines de rhoptries.
Abstract
Le paludisme entraîne une morbidité et une mortalité importantes mondiale. Aucun vaccin de routine est actuellement disponible. Une des principales raisons de l'absence d'un vaccin est le défi d'identifier des candidats vaccins appropriés. Protéines paludéennes exprimés en utilisant des systèmes d'expression à base de cellules procaryotes et eucaryotes sont mal glycosylés, généralement insolubles et subissent pliage impropre menant à immunogénicité réduite. Les systèmes d'expression exempt de germes de blé, de reticulocytes de lapin et Escherichia coli lysat cellulaire de lysat sont actuellement utilisés pour l'expression de protéines paludiques. Toutefois, la durée de temps d'expression et inappropriée glycosylation des protéines reste un défi. Nous démontrons l'expression de protéines de Plasmodium in vitro en utilisant des systèmes de la libre expression de cellules HeLa base, appelées "cellules sans systèmes d'expression in vitro humains». Les systèmes d'expression de cellules HeLa 2 basé libres transcrire l'ARNm en 75 min et 3 ul de transcribed ARNm est suffisante pour traduire des protéines en 90 min. Le système d'expression est une étape de transcription et une traduction couplé système d'expression; la transcription et la traduction co-produit dans 3 heures. Le processus peut également être prolongé pour 6 heures en fournissant une énergie supplémentaire. Dans le système d'expression en 2 étapes, l'ARNm est transcrit premier et ensuite ajouté au mélange de traduction de l'expression des protéines. Nous décrivons comment exprimer des protéines de paludisme; hydrophobe Fente de PF3D7_0114100 Maurer – 2 transmembranaire (GCFP-2TM) protéine, une protéine de PF3D7_0925900 hydrophile et une répétition de tatou contenant des protéines PF3D7_1361800, en utilisant le système de la libre expression dans des cellules HeLa base. Les protéines sont exprimées dans des micro volumes utilisant des stratégies d'expression en 2 étapes et 1-étape. Procédé de purification par affinité pour purifier 25 ul de protéines exprimées à l'aide du système cellulaire humaine libre d'expression in vitro est également décrit. le rendement en protéines est déterminée par le test de Bradford et l'a expriméet des protéines purifiées peuvent être confirmés par une analyse Western blot. Protéines recombinantes exprimées peuvent être utilisées pour des analyses immunologiques et des vaccinations, le séquençage de protéines.
Introduction
Dans la recherche du paludisme, l'expression de protéines immunogènes en utilisant des systèmes à base cellulaires procaryotes ou eucaryotes reste un défi. L'AT richesse du génome de Plasmodium et les mécanismes post-traductionnelles inconnus 14,7, contribuent aux difficultés liées à l'obtention des protéines correctement repliées et immunogènes pour les études de production d'anticorps et de vaccins. Des systèmes procaryotes tels que Escherichia coli ont été utilisés pour l'expression de protéines recombinantes. Systèmes procaryotes sont à faible coût, efficaces, produisent des rendements élevés de protéine recombinante et disposer de plusieurs vecteurs de clonage. Hôte E. coli cellules sont faciles à transformer et les cellules croissent rapidement. Cependant, les systèmes procaryotes ont des limitations telles que le manque de substitution d'acides aminés, la modification post-traductionnelle, le risque de contamination, les produits hétérogènes et l'accumulation de protéines recombinantes à l'intérieur des corps d'inclusion 24.
Dans unétude de Mehlin et al. (2006), 1000 cadres de lecture ouverts (ORF) ont été exprimés. Environ 7% des protéines exprimées étaient solubles 14. L'insolubilité est observée en raison de la nature polarisée de gènes et la haute fréquence de codons qui sont utilisés de préférence par le Plasmodium riche en AT 14 génome. Une autre stratégie pour surmonter ce problème a été mis au point en utilisant des plasmides ou des cellules hôtes contenant les ARNt qui reconnaissent les codons ou des codons qui correspondent aux fréquences 3 rares. Même après l'exécution de ces optimisations, de très petites portions de protéines sont exprimées comme soluble, active et immunogène 14. Les systèmes d'expression sans cellules contiennent tous les composants nécessaires pour la transcription et la traduction tels que les ribosomes, les facteurs d'initiation, les facteurs d'allongement (traductions facteurs), et ARNt aminoacyl-ARNt synthétases. Les deux réactions de transcription et de traduction sont couplées en une étape procédure 11,29. Le transcriréaction d'ption est effectuée dans un tube avant quantité appropriée d'ARNm est incubée avec de la machinerie de traduction dans un tube différent 11,29. Bien que ces méthodes sont efficaces dans Plasmodium sp. Expression de la protéine, un inconvénient majeur est la longueur de temps pour l'expression de la protéine, ce qui est environ 22 h 29. En outre, le coût élevé des fournitures pour l'inclusion dans les protocoles 29, les préparatifs de la main-d'œuvre du lysat cellulaire et des incohérences dans les préparations de composants, de rendre ces systèmes inaccessible. L'objectif principal de chercheurs pour le développement d'un système d'expression sans cellule dépend de facteurs tels que la modification génétique rapide, les rendements rapides avec des concentrations élevées et droites préparations de lysat à terme 1.
Les systèmes eucaryotes tels que les levures, les lignées cellulaires de mammifères, de baculovirus système d'expression à médiation par, Tetrahymena thermophilie, Dictyostelium discoideum et des systèmes d'expression parasites such comme Leishmania ont été utilisées pour l'expression de protéines recombinantes 7. Les systèmes eucaryotes part relation phylogénétique et donc part également des caractéristiques telles que la glycosylation, l'acylation, la formation de liaison disulfure, une interaction chaperonne, la protéolyse et sous-compartimentalisation cellulaire. Protéines événements de sécrétion chez les eucaryotes empêchent l'accumulation et diminue la toxicité pour les systèmes d'expression 13. L'utilisation de systèmes de levure est préféré comme ils sont indiqués pour l'expression de protéines à grande échelle et pour obtenir des rendements élevés 4. Deux P. protéines falciparum PFCP-29 et Pvs25 ont été produits en utilisant le système de levure 4. Cependant, un inconvénient majeur dans la synthèse de la plupart des protéines était motifs irréguliers N et O-glycosylation, pliage impropre et la troncature des protéines à partir de leur forme native 4.
L'utilisation de cellules de mammifères pour la synthèse de protéines recombinantes est laborieux et il est expensive pour maintenir des lignées de cellules recombinantes stables 4. Par conséquent, les cellules de mammifères ont été limitées pour l'analyse de la signalisation de protéine, les interactions entre protéines et d'interactions hôte-parasite et également pour tester des vaccins à ADN 4. L'ADN et l'ARNm humain vitro système exempt de cellules d'expression de protéine décrite ici est dans un système à base de mammifère dérivé des cellules HeLa qui exprime des protéines dans 3 heures. Protéines exprimées en utilisant le vecteur d'expression pT7CFE1-CHIS ont une étiquette de C-terminal de faciliter l'identification et la purification. Le système basé sur des cellules HeLa est complétée avec des facteurs d'initiation de traduction et un régulateur de traduction, ce qui améliore l'efficacité du système de traduction. Les protéines peuvent être rapidement traduits, sélectionnés, vérifiés et traités pour une utilisation dans diverses applications immunologiques et structurelles 15.
Des systèmes d'expression eucaryotes acellulaires tels que le germe de blé et de reticulocytes de lapin sont actuellement utilisés pour l'expression de varprotéines eucaryotes dif- y compris les protéines de Plasmodium 11,29. En outre, E. des systèmes exempts de cellules sur la base coli sont également employés pour l'expression des protéines eucaryotes 11. Le tableau 1 résume les différents systèmes d'expression de cellules libres en comparant les caractéristiques des systèmes, ainsi que la facilité d'utilisation des systèmes pour l'expression des protéines. Le système exempt de cellules humaines par rapport aux autres a la capacité d'effectuer et soumettre co-traductionnelle modifications et est moins coûteux. L'optimisation des codons est possible et l'ensemble des réactions peut être effectuée en 3 heures. Le système HeLa est un système de traduction idéal pour la synthèse des protéines dans le laboratoire.
Un avantage majeur de connexion des systèmes d'expression cellulaires humaines par rapport aux autres systèmes acellulaires est la disponibilité de plusieurs lignées cellulaires différentes provenant de différents organes et tissus. Plusieurs variétés de systèmes exempts de cellules peuvent être conçues en fonction de la lignée cellulaire. L'extraits dérivés de cellules de mammifère ont un rendement plus élevé pour synthétiser de grandes protéines que les autres systèmes d'expression de cellules libres. Ces systèmes d'expression de cellule libre peuvent également être utilisés dans des applications de diagnostic et de caractérisation des protéines telles que 30 microréseaux. Les lignes de cellules HeLa populaires sont les plus largement utilisés pour réaliser l'expression de protéines 33. Le réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires HeLa est peu développé, d'où l'absence de glycosylation post-traductionnelle 33 activité de modification. Cependant, ce système est considéré comme étant avantageux pour la synthèse des protéines de Plasmodium comme Plasmodium manque également de glycosylation après modification de traduction 29. La connexion de protocole de transcription-traduction cellule HeLa est facile à réaliser, peu coûteux et de protéines peut être exprimée en 90 min, prêt pour la purification et d'autres applications en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes importantes pour l'expression réussie de protéines en utilisant deux étapes dans le système de cellule humaine de la libre expression et la purification vitro sont: 1) l'amplification réussie et le clonage de gènes dans le vecteur plasmidique pT7CFE-Chis; 2) la transcription de l'ARN à 30 ° C; 3) la traduction de protéine à 30 ° C en présence d'inhibiteur de la RNAse; 4) le développement du protocole de purification par affinité en utilisant des billes à base de rés…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
References
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
