İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em> Plasmodium</em> Rhoptry Proteinler
Summary
Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.
Abstract
Sıtma önemli küresel morbidite ve mortaliteye neden. Hiçbir rutin aşı mevcut değildir. Bir aşının olmaması için en önemli nedenlerinden biri, uygun aşı adayları belirleme mücadeledir. Sıtma proteinleri prokaryotik ve ökaryotik hücre tabanlı ifade sistemleri zayıf düşürülmüş immünojenikliği giden uygunsuz katlama, genellikle çözünmez glıkosıle ve tabi olan kullanarak dile getirdi. buğday tohumu, tavşan retikülosit lizat ve Escherichia coli lisat hücresiz sentezleme sistemleri şu anda sıtma protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Ancak, ifade, zaman ve proteinlerin yanlış glikolizasyonu uzunluğu hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu "in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri" olarak adlandırılan HeLa göre hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak in vitro Plasmodium proteinlerin sentezlenmesini göstermektedir. 2 HeLa tabanlı cep özgür ifade sistemleri 75 dakika ve transcrib 3 ul mRNA uyarlamaked mRNA, 90 dakika proteinleri çevirmek yeterlidir. 1 adım sentezleme sistemi, bir transkripsiyon ve translasyon bağlanmış sentezleme sistemidir; transkripsiyonu ve eş için 3 saat içinde oluşur. süreci de ek enerji sağlayarak 6 saat süreyle uzatılabilir. 2 adımlı sentezleme sisteminde, mRNA, ilk transkripsiyonu ve daha sonra protein ekspresyonu için yapıldı karışımına ilave edildi. Biz sıtma proteinleri ifade açıklanmıştır; bir hidrofobik PF3D7_0114100 Maurer'in Yarık – 2 transmembran (KMYKK-2TM) proteini, bir hidrofilik PF3D7_0925900 proteini ve HeLa göre hücresiz sentezleme sistemi kullanılarak protein PF3D7_1361800 ihtiva eden bir armadillonun tekrarlar. Proteinler 2-adım ve 1 adım ifadesi stratejilerini kullanan mikro hacimlerde ifade edilir. Bir afinite saflaştırma yöntemi de tarif edilir ve in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemi kullanılarak ifade edilen proteinlerin 25 ul saflaştırmak için. Protein verimi Bradford tahliliyle belirlenir ve ekspreseve saflaştırılmış proteinler Western lekesi analizi ile teyit edilebilir. Sentezlenen rekombinant proteinler, aşılar, bağışıklık ve protein dizilemesi için kullanılabilir.
Introduction
Sıtma araştırmada, prokaryotik ya da ökaryotik hücre bazlı sistemler kullanılarak imünojenik protein ekspresyonu, bir sorun olmaya devam etmektedir. Plasmodium genomu ve bilinmeyen post-translasyonel mekanizmalar 14,7, AT zenginliği, antikor üretimi ve aşı çalışmaları için uygun bir şekilde katlanmış ve immünojenik proteinlerini elde etmekle bağlantılı güçlükler katkıda bulunur. Escherichia coli gibi prokaryotik sistemlerde rekombinan protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Prokaryotik sistemleri, etkili, düşük maliyetli olan rekombinant proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi ve birden çok klonlama vektörleri. E. Ev Sahipliği E. coli hücrelerini dönüştürmek için kolay ve hızlı bir şekilde hücreler büyür. Bununla birlikte, prokaryotik sistemler gibi amino asit ikamesi, post-translasyonel modifikasyon, inklüzyon gövdelerinin 24 içinde kirlenme heterojen ürünlerin ve rekombinant proteinlerin birikmesi riski eksikliği gibi sınırlılıklara sahiptir.
IçindeMehlin ve arkadaşları tarafından çalışma. (2006), 1000, açık okuma çerçeveleri (ORF) olarak ifade edildi. Ifade edilen proteinlerin yaklaşık% 7 çözünen 14 idi. gözlenen çözünmeme genlerinin önyargılı doğası ve zengin genom 14 AT Plasmodium tarafından ideal kullanılan kodonların yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için bir alternatif strateji, plazmidler veya nadir kodonları ya da frekansları 3 eşleşen kodonları tanıyan tRNAs ihtiva eden konakçı hücreler kullanılarak geliştirilmiştir. Hatta bu en iyi duruma gerçekleştirdikten sonra, proteinler, çok küçük bölümleri, çözülebilir aktif 14 imünojenik olarak ifade edilmiştir. hücresiz sentezleme sistemleri, ribozom, başlatma faktörleri, uzatma faktörleri (çevirileri faktörler), tRNA ve aminoasil-tRNA sentetaz olarak transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Hem transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları tek aşamalı prosedür 11,29 içinde birleştirilir. transcrimRNA uygun bir miktar farklı boru 11,29 çeviri makine ile inkübe edilmeden önce ption Reaksiyon tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, Plasmodium sp., Protein ekspresyonu başarılı olsa da, önemli bir dezavantajı, yaklaşık 22 saat 29 olan protein ekspresyonu için zaman dilimidir. Buna ek olarak, protokoller 29 eklenmek üzere malzeme yüksek maliyet, bileşen hazırlıkları emek-yoğun hücre lizatının hazırlıkları ve tutarsızlıklar, bu sistemler ulaşılamaz olun. Bir hücre özgür ifade sisteminin geliştirilmesi için araştırmacıların ana odak bu hızlı genetik modifikasyon, yüksek konsantrasyonlarda ve yalındır lisatı hazırlıkları 1 hızlı verim gibi faktörlere bağlıdır.
Maya, memeli hücre çizgileri, bakulovirüs dolayımlı sentezleme sistemi, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum ve parazitik ekspresyon sistemleri su olarak ökaryotik sistemlerdeLeishmania olarak kanal yeniden birleştirici protein ekspresyonu 7 kullanılmaktadır. Ökaryotik sistemler filogenetik ilişkiyi paylaşmak ve bu nedenle de bu tür glikosilasyon, asilleme, disülfür bağı oluşumu, hastabakıcı etkileşimi, proteoliz ve alt hücresel bölümlendirme gibi özelliklere paylaşabilirsiniz. Ökaryotlarda protein salgılanması olayları birikmesini önlemek ve ifade sistemleri 13 toksisite azalır. bunlar, büyük ölçekli protein ekspresyonu için ve yüksek verim 4 elde etmek için uygun olan maya sistemlerinin kullanılması tercih edilir. İki P. falsiparum proteinleri PfCP-29 ve Pvs25 maya sistemi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin çoğu sentezinde önemli bir dezavantajı, düzensiz N ve O-glikosilasyon modelleri, uygun olmayan katlama ve doğal biçiminde 4 proteinlerin kesme oldu.
Rekombinant proteinlerin sentezi için memeli hücrelerinin kullanımı, emek yoğun ve masraflı olup bustabil yeniden birleştirici hücre çizgileri 4 muhafaza etmek sive. Bu nedenle, memeli hücreleri, protein sinyalizasyon, protein etkileşimleri ve parazit konakçı etkileşimleri analiz için sınırlı kalmıştır ve DNA aşıları 4 test etmek için. Burada tarif edilen insan DNA'sı ve mRNA in vitro protein ekspresyonu, hücre içermeyen sistemi 3 saat proteinleri eksprese eden bir HeLa hücre-türevli, memeli-bazlı bir sistemdir. Proteinler kimlik ve saf hale getirilmesini kolaylaştıran bir C-terminali etiket pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü olan kullanılarak ifade edilir. HeLa tabanlı sistem, böylece çeviri sisteminin etkinliğinin artırılması, çeviri başlatma faktörleri ve çeviri regülatörü ile takviye edilmiştir. Proteinler hızla çevrilmiştir filtrelenmiş, belirlenmiş ve çeşitli immünolojik ve yapısal uygulamalar 15 kullanılmak üzere işlenebilir.
Buğday tohumu ve tavşan retikülosit gibi ökaryotik hücre içermeyen sentezleme sistemleri şu anda var ekspresyonu için kullanılanPlasmodium proteinleri de dahil olmak üzere 11,29 ious ökaryotik proteinler. Buna ek olarak, E. E. coli göre hücre içermeyen sistemler de ökaryotik protein ekspresyonu için kullanılmaktadır 11. Tablo 1, sistemin özelliklerinin yanı sıra, protein ekspresyonu için sistemler kullanılarak kolaylığı karşılaştırarak farklı hücre serbest sentezleme sistemleri özetlemektedir. diğerlerine kıyasla insan hücresi serbest sistemi sonrası ve co-translasyonel modifikasyonlar yapmak yeteneğine sahiptir ve daha az pahalıdır. Kodon optimizasyonu da mümkündür ve bütün reaksiyonlar, 3 saat içinde uygulanabilir. HeLa sistem laboratuvar ortamında protein sentezi için ideal bir çeviri sistemidir.
Diğer hücre barındırmayan sistemler üzerinde insan hücre serbest sentezleme sistemlerinin önemli bir avantajı, farklı organ ve dokularda türetilen birkaç farklı hücre hatları mevcudiyetidir. Hücresiz sistemlerin pek çok çeşidi, hücre hattı ile ilgili olarak dizayn edilebilir. özütMemeli hücrelerinden türetilen ler başka hücre özgür ifade sistemlerine göre büyük proteinleri sentezlemek için yüksek verimliliğe sahiptir. Bu hücresiz sentezleme sistemleri, aynı zamanda, mikro dizileri 30 gibi teşhis ve protein karakterizasyon uygulamalarında kullanılabilir. Popüler HeLa hücre hatları, en yaygın olarak protein 33 ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılır. HeLa hücre hatları, endoplazmik retikulum post-translasyonel glikosilasyon modifikasyon aktivitesi 33 yokluğuna yol az gelişmiştir. Bununla birlikte, bu sistem, aynı zamanda, Plasmodium glikosilasyon sonrası değişikliği bir 29 yoksun olarak Plasmodium protein sentezi için yararlı olduğuna inanılmaktadır. HeLa hücre serbest transkripsiyon için protokol, ucuz, kolay uygulanabilir ve proteinlerin saflaştırılması ve daha sonraki alt akış uygulamaları için hazır, 90 dakika içinde ifade edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve arıtma iki adımı kullanarak proteinin başarılı bir şekilde ifadesi için önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 o C RNA transkripsiyonu; RNaz inhibitör varlığında, 30 ° C'de protein 3) yapıldı; 4) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 5 ile kaplı haplar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
References
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
