Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em> Plasmodium</em> Rhoptry Proteínas

Summary

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Abstract

A malária causa de morbidade e mortalidade mundial significativa. Nenhuma vacina de rotina está disponível no momento. Uma das principais razões para a falta de uma vacina é o desafio de identificar candidatos a vacinas adequadas. Proteínas malária expresso utilizando sistemas procariotas e eucariotas de expressão baseados em células são mal glicosilada, geralmente insolúveis e passam por dobragem inadequada levando a imunogenicidade reduzida. Os sistemas de expressão livres de gérmen de trigo, lisado de reticulócitos de coelho e lisado de células de Escherichia coli são actualmente utilizados para a expressão de proteínas da malária. No entanto, o período de tempo e a expressão inadequada de glicosilação de proteínas continua a ser um desafio. Nós demonstramos a expressão de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando células HeLa sistemas baseados livre expressão, denominados "in vitro de células livre sistemas de expressão humanos". Os sistemas de expressão isentos de células HeLa baseado 2 transcrever o ARNm em 75 min e 3 ul de transcribed ARNm é suficiente para traduzir proteínas em 90 min. O sistema de expressão de um-passo é uma transcrição e tradução acoplado sistema de expressão; a transcrição e tradução de co-ocorre em 3 h. O processo também pode ser estendido durante 6 horas, fornecendo energia adicional. No sistema de expressão de 2 passos, o ARNm é transcrita em primeiro lugar e, em seguida, adicionados à mistura de tradução para a expressão da proteína. Nós descrevemos como expressar proteínas de malária; um hidrofóbico Cleft de PF3D7_0114100 Maurer – 2 proteína transmembranar (CGFP-2TM), uma proteína PF3D7_0925900 hidrófilo e um tatu repetições contendo proteína PF3D7_1361800, utilizando o sistema de livre expressão de células HeLa base. As proteínas são expressas em micro volumes empregando 2-passo e um passo-estratégias de expressão. Um método de purificação por afinidade para purificar a 25 ul de proteínas expressas utilizando o sistema isento de células humanas de expressão in vitro é também descrito. Rendimento de proteína é determinada pelo ensaio de Bradford e a expressoe proteínas purificadas pode ser confirmada por análise de transferência de western. Proteínas recombinantes expressas podem ser utilizados para a vacinação, imunoensaios e sequenciação de proteínas.

Introduction

Na pesquisa da malária, a expressão de proteínas imunogénicas utilizando sistemas baseados em células procarióticas ou eucarióticas continua a ser um desafio. A riqueza AT do genoma de Plasmodium e desconhecidos os mecanismos pós translacionais ^14,7, contribuir para as dificuldades associadas com a obtenção de proteínas correctamente dobradas e imunogénicos para produção de anticorpos e estudos de vacinas. Sistemas procariotas tais como Escherichia coli, têm sido utilizados para a expressão da proteína recombinante. Sistemas procariotas são de baixo custo, eficaz, produzir altos rendimentos de proteína recombinante e ter vários vectores de clonagem. Anfitrião E. coli são fáceis de transformar e células crescem rapidamente. No entanto, os sistemas procarióticos têm limitações, tais como a falta de substituição de aminoácidos, modificação pós-translacional, risco de contaminação, produtos heterogéneos e acumulação de proteínas recombinantes dentro de corpos de inclusão ^24.

Em umestudo realizado por Mehlin et al. (2006), 1000 grelhas de leitura aberta (ORF) foram expressos. Aproximadamente 7% das proteínas expressas foram solúvel ^14. A insolubilidade observado é devido à natureza tendenciosa dos genes e da alta freqüência de códons que são usados ​​idealmente pelo Plasmodium AT genoma rico ^14. Uma estratégia alternativa para ultrapassar este problema foi desenvolvido usando plasmídeos ou células hospedeiras contendo ARNt que reconhece codões raros ou codões que correspondem aos ^três frequências. Mesmo depois de executar essas otimizações, muito pequenas porções de proteínas são expressas como solúvel, ativa e imunogênica ^14. Os sistemas de expressão isentos de células contêm todos os componentes necessários para a transcrição e tradução, tais como os ribossomos, fatores de iniciação, factores de alongamento (traduções fatores), tRNA e aminoacil-tRNA. Ambas as reacções de transcrição e de tradução são acopladas no procedimento de um só passo ^11,29. O transcriPÇÃO reacção é realizada num tubo antes quantidade adequada de mRNA é incubada com uma maquinaria de tradução em ^11,29 tubo diferente. Embora estes métodos são bem sucedidos em Plasmodium sp. A expressão da proteína, uma grande desvantagem é o período de tempo para a expressão da proteína, que é de aproximadamente 22 h ^29. Além disso, o alto custo dos materiais para inclusão nos protocolos ^29, os preparativos de trabalho intensivo do ligado celular e inconsistências nos preparativos de componentes, tornar esses sistemas inatingível. O principal foco dos pesquisadores para o desenvolvimento de um sistema de expressão livre de células depende de fatores como a rápida modificação genética, os rendimentos rápidos com altas concentrações e preparações lisado para a frente em linha reta ^1.

Os sistemas eucarióticos, tais como leveduras, linhas celulares de mamíferos, baculovírus sistema de expressão mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemas de expressão parasitárias such como Leishmania foram utilizados para a expressão da proteína recombinante ^7. Os sistemas eucarióticos partes relação filogenética e, por conseguinte, também partilham características, tais como glicosilação, acilação, formação de ligação dissulfureto, interacção chaperona, proteólise e compartimentalização sub-celular. Eventos secreção de proteínas em eucariotas evitar a acumulação e toxicidade diminui para sistemas de expressão ^13. A utilização de sistemas de leveduras é preferível que elas sejam adequadas para a expressão de proteínas em grande escala e para a obtenção de rendimentos elevados ^4. Dois P. proteínas falciparum PfCP-29 e Pvs25 foram produzidas utilizando o sistema de levedura ^4. No entanto, uma grande desvantagem na síntese da maioria das proteínas foi padrões irregulares de N e O-glicosilação, truncagem e dobragem incorrecta de proteínas a partir da sua forma nativa ^4.

A utilização de células de mamíferos para a síntese de proteínas recombinantes é trabalho intensivo e é expensive para manter linhas de células recombinantes estáveis ^​​4. Portanto, as células de mamíferos têm-se limitado para a análise de sinalização de proteína, as interacções proteína e interacções hospedeiro-parasita e também para testar as vacinas de ADN ^4. O ADN humano e de ARNm no sistema in vitro isento de células de expressão da proteína aqui descrito é um sistema de mamífero baseados em derivados de células HeLa que expressam as proteínas em 3 h. As proteínas expressas utilizando pT7CFE1-chis vetor de expressão têm uma tag C-terminal facilitando a identificação e purificação. O sistema de base de HeLa é suplementado com factores de iniciação da tradução e um regulador de tradução, aumentando assim a eficiência do sistema de tradução. As proteínas podem ser rapidamente traduzidos, peneirados, verificado e processado para uso em várias aplicações imunológicas e estruturais ^15.

Os sistemas de expressão isentos de células eucarióticas, tais como germe de trigo e de reticulócitos de coelho são actualmente utilizados para a expressão de varproteínas eucarióticas ious incluindo proteínas de Plasmodium ^11,29. Além disso, a E. sistemas livres de células com base coli também são empregues para a expressão da proteína eucariótica ^11. A Tabela 1 resume os diferentes sistemas de expressão de células livres, comparando as características dos sistemas, bem como a facilidade da utilização dos sistemas para a expressão da proteína. O sistema isento de células humano em comparação com os outros tem a capacidade de executar pós e co-translacional modificações e é menos dispendiosa. Codon optimization é possível e todas as reacções podem ser realizadas em 3 h. O sistema de HeLa é um sistema de tradução ideal para a síntese de proteína no ambiente de laboratório.

Uma grande vantagem dos sistemas de expressão de células humanas livre em relação a outros sistemas livres de células, é a disponibilidade de várias linhas celulares diferentes derivadas de diferentes órgãos e tecidos. Existem diversas variedades de sistemas isentos de células pode ser desenhado dependendo da linha celular. O extractos derivados a partir de células de mamífero têm uma maior eficiência de sintetizar proteínas grandes do que quaisquer outros sistemas de expressão de célula livre. Estes sistemas de células sem expressão podem também ser utilizados em aplicações de diagnóstico e caracterização de proteínas, tais como micro matrizes ^30. As linhas de células HeLa populares são mais amplamente utilizados para realizar a expressão de proteínas ^33. O retículo endoplasmático nas linhas de células HeLa é subdesenvolvidos, levando à ausência de glicosilação pós-tradução actividade modificação ^33. No entanto, este sistema é que se acredita ser vantajoso para a síntese de proteínas Plasmodium Plasmodium como também não possui modificação pós tradução ²⁹ glicosilação. O protocolo de transcrição-tradução livre de células HeLa é de fácil execução, barata e as proteínas podem ser expressas em 90 min, pronta para a purificação e aplicações a jusante.

Protocol

1. Preparação de culturas de células de parasitas, Coleção de Parasite Pellets Prepare meio RPMI-1640-HEPES por adição de 10 g de pó de meio RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sódio, tampão HEPES 5,9 g, 50 mg de hipoxantina e 3,8 g de dextrose em 1 L estéril dH 2 O. Misture usando a tabela agitador magnético até que todos o pó se dissolva em 1 L de água destilada. Execute micro filtração de mídia usando 0,22 nm. Armazene a mídia em frascos esteriliz…

Representative Results

Validação das proteínas recombinantes expressas através de reactividade com anticorpos específicos é um primeiro passo importante para confirmar a dobragem correcta das proteínas expressas. Proteínas da malária recombinantes foram expressos utilizando o passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas recombinantes são o método de afinidade de Ni-quelante purificada. Em seguida, usamos anti-soros contra roptrias inteiras merozoite em transferência Western d…

Discussion

Os passos importantes para a expressão bem sucedida das proteínas em dois passos, utilizando em sistema de expressão de células humanas in vitro livre e purificação são: 1) a amplificação bem sucedida e clonagem de genes em pT7CFE-Chis plasmídeo vector; 2) a transcrição do RNA a ^{30 °} C; 3) a tradução de proteína a 30 ° C na presença de inibidor de ARNase; 4) desenvolver o protocolo de purificação de afinidade com base usando esferas de resina revestidos com Ni e 5) análise de resultados e…

Materials

Two-step in vitro human cell free expression system	Thermo fischer	88856	Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
One-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at room temperature
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4oC.