מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em> Plasmodium</em> Rhoptry חלבונים
Summary
ביטוי של חלבוני מלריה במערכות תא מבוסס נותר מאתגר. אנו מדגימים שתי מערכות ביטוי תא חופשי צעד וIVT צעד אחד (בתרגום חוץ גופית) לביטוי חלבוני rhoptry רקומביננטי מלריה מתאי הלה. אנו משתמשים במערכת לטיהור מבוססת זיקת Ni-שרף לטהר את חלבוני rhoptry.
Abstract
המלריה גורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות גלובליות. אין חיסון שגרתי זמין כעת. אחת הסיבות העיקריות לחוסר חיסון הוא האתגר של זיהוי מועמדי חיסון מתאימים. חלבוני מלריה הביעו באמצעות מערכות ביטוי תא מבוססות פרוקריוטים ואוקריוטים גרועים הם glycosylated, בדרך כלל לא מסיסות ולעבור קיפול לא נכון המובילים לחיסוני מופחתים. מערכות הביטוי חופשיות תא lysate נבט חיטה, lysate reticulocyte הארנב וcoli Escherichia כיום משמשות לביטוי של חלבוני מלריה. עם זאת, משך זמן ביטוי וglycosylation לא תקינה של חלבונים עדיין אתגר. אנו מדגימים ביטוי של חלבוני Plasmodium במבחנה באמצעות מערכות ביטוי חופשי תא מבוסס הלה, המכונות "מערכות במבחנה אנושיות תא חופשי ביטוי". מערכות ביטוי 2 הלה התא מבוסס חופשיות לתמלל mRNA ב -75 דקות ו -3 μl של transcribאד mRNA מספיק כדי לתרגם חלבונים ב -90 דק '. מערכת הביטוי 1-הצעד היא מערכת ביטוי בשילוב תרגום שעתוק ו; השעתוק ותרגום שיתוף מתרחש בשעה 3. התהליך גם יכול להתארך למשך 6 שעות על ידי אספקת אנרגיה נוספת. במערכת הביטוי 2-הצעד, mRNA הוא עיבד ראשון ולאחר מכן הוסיף לתערובת התרגום לביטוי חלבון. אנו מתארים איך לבטא את חלבוני מלריה; השסוע של PF3D7_0114100 מאוורר הידרופובי – חלבון 2 הטרנסממברני (PfMC-2TM), חלבון PF3D7_0925900 הידרופילי וחוזר ארמדיל המכיל חלבון PF3D7_1361800, באמצעות מערכת הביטוי חופשי תא מבוסס הלה. החלבונים באים לידי ביטוי בכמויות מייקר העסקת אסטרטגיות ביטוי 2-צעד והצעד 1. שיטת טיהור זיקה לטהר 25 μl של חלבונים הביעו באמצעות מערכת חופש הביטוי במבחנה התא אנושי גם מתוארת. תשואת חלבון נקבעה על ידי assay של רדפורד והביעוניתן לאשר חלבונים מטוהרים על ידי ניתוח מערבי סופג. חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי יכולים לשמש לחיסונים, immunoassays ורצף חלבון.
Introduction
במחקר מלריה, ביטוי של חלבונים חיסוניים באמצעות מערכות תא פרוקריוטים או אוקריוטים מבוססים עדיין מהווה אתגר. עושר AT של הגנום Plasmodium ומנגנונים שלאחר translational ידועים 14,7, תורם לקשיים הקשורים בקבלת חלבונים מקופלים וחיסוניים כראוי ללימודי ייצור נוגדנים וחיסון. מערכות פרוקריוטים כגון coli Escherichia שימשו לביטוי חלבון רקומביננטי. מערכות פרוקריוטים הן בעלות נמוכה, יעילות, לייצר תשואות גבוהות של חלבון רקומביננטי ויש לי וקטורי שיבוט מרובים. לארח E. תאי coli הם קל להפוך ותאים לצמוח במהירות. עם זאת, יש לי מערכות פרוקריוטים מגבלות כגון חוסר תחלופה אמינו חומצה, שינוי שלאחר translational, סיכון לזיהום, מוצרים הטרוגניים והצטברות של חלבונים רקומביננטי בתוך גוף הכללה 24.
במחקר על ידי אל Mehlin et. (2006), 1000 מסגרות פתוחות קריאה (ORF) באו לידי ביטוי. כ -7% מהחלבונים הביעו היו 14 מסיסים. Insolubility נצפה הוא בשל האופי המגמתי של גנים והתדירות הגבוהה של קודונים המשמשות באופן אידיאלי על ידי Plasmodium AT הגנום עשיר 14. אסטרטגיה חלופית להתגבר על בעיה זו פותחה על ידי שימוש בפלסמידים או תאי מארח מכילים tRNAs שיכיר קודונים או קודונים התואמים את התדרים 3 נדירים. גם לאחר ביצוע אופטימיזציות אלה, מנות קטנות מאוד של החלבונים באות לידי ביטוי כמסיס, פעיל וחיסוני 14. מערכות ביטוי התא ללא מכילות את כל הרכיבים דרושים לשעתוק ותרגום כגון ריבוזומים, גורמי ייזום, גורמי התארכות (גורמי תרגומים), tRNA וsynthetases aminoacyl-tRNA. שני תגובות השעתוק ותרגום הם מצמידים ב11,29 הליך צעד אחד. Transcriתגובת ption מתבצעת בצינור לפני הכמות המתאימה של mRNA היא מודגרות עם מכונות תרגום ב11,29 צינור שונה. למרות ששיטות אלה בהצלחה בPlasmodium sp. ביטוי חלבון, חסרון עיקרי הוא משך זמן לביטוי חלבונים, שהם כ -22 שעות 29. בנוסף, העלות הגבוהה של ציוד להכללה בפרוטוקולים 29, הכנות עתירות העבודה של lysate התא וחוסר עקביות בהכנות רכיב, להפוך את המערכות אלה אינן ניתנות להשגה. המוקד העיקרי של חוקרים לפיתוחה של מערכת ביטוי חופשית תא תלוי בגורמים כגון הנדסה גנטית מהירה, תשואות מהירות עם ריכוזים גבוהים והכנות lysate ישר קדימה 1.
מערכות אוקריוטים כגון שמרים, שורות תאי יונקים, מערכת ביטוי בתיווך baculovirus, thermophilia Tetrahymena, discoideum Dictyostelium ומערכות ביטוי טפילים suפרק כשושנת יריחו שימש לביטוי חלבון רקומביננטי 7. מערכות אוקריוטים לשתף יחסי פילוגנטי ולכן גם חולקות מאפיינים כגון glycosylation, acylation, אג"ח disulphide היווצרות, אינטראקציה מלווה, proteolysis ומידור תת-תאי. אירועי הפרשת חלבון באאוקריוטים למנוע הצטברות ומקטין רעילות למערכות ביטוי 13. השימוש בשמרי מערכות עדיפים כפי שהם מתאימים לביטוי חלבון בקנה מידה גדולה ולהשגת תשואות גבוהות 4. שני פ חלבוני falciparum PfCP-29 וPvs25 הופקו באמצעות מערכת השמרים 4. עם זאת, חסרון עיקרי בסינתזה של רוב החלבונים היה דפוסי N ו- O-glycosylation לא סדירים, קיפול וחיתוך של חלבונים מהצורה הטבעית שלהם 4 לא תקינים.
השימוש בתאי יונקים לסינתזה של חלבונים רקומביננטי הוא עתיר עבודה והוא expensive לשמור שורות תאי רקומביננטי יציבים 4. לכן, תאי יונקים היו מוגבלים לניתוח איתות חלבון, אינטראקציות חלבון ואינטראקציות טפילות-מארח וגם לבדיקה חיסוני DNA 4. ה- DNA האנושי ומערכת ה- mRNA במבחנה ביטוי חלבון תא ללא מתואר במסמך זה מערכת תאים שמקורם הלה מבוסס יונקים המבטאת חלבונים ב 3 שעות. חלבונים הביעו באמצעות וקטור ביטוי pT7CFE1-cHis יש תג C-המסוף מאפשר זיהוי וטיהור. המערכת מבוססת הלה הוא השלים עם גורמי חניכת תרגום ותרגום רגולטור, ובכך משפרת את היעילות של מערכת התרגום. חלבונים יכולים להיות מתורגמים במהירות, הוקרנו, מאומת ומעובד לשימוש ביישומים חיסוניים ומבניים שונים 15.
מערכות ביטוי אוקריוטים תא ללא כגון נבט חיטה וreticulocyte הארנב משמשות כיום לביטוי של varחלבוני אוקריוטים ious כוללים חלבוני Plasmodium 11,29. בנוסף, ה מערכות תא ללא מבוססות coli גם מועסקות לביטוי חלבון אוקריוטים 11. טבלת 1 מסכמת מערכות ביטוי תא חופשי שונות על ידי השוואת תכונות של המערכות, כמו גם את קלות שימוש במערכות לביטוי חלבונים. יש מערכת התא ללא אדם בהשוואה לאחרים את היכולת לבצע שינויי פוסט ושיתוף translational ופחות יקר. אופטימיזציה קודון היא אפשרית וניתן לבצע את כל התגובות בשעה 3. מערכת הלה היא מערכת תרגום אידיאלית לסינתזת חלבון במעבדת ההגדרה.
יתרון עיקרי של מערכות ביטוי אנושיות תא חופשי על פני מערכות אחרות תא ללא הוא הזמינות של כמה שורות תאים שונות הנגזרות מאיברים ורקמות שונים. כמה סוגים של מערכות תא ללא יכולים להיות מתוכננים בהתאם לקו התא. התמציתיש לי של מקורם בתאי יונקים יעילות גבוהה יותר לסנתז חלבונים גדולים יותר מכל מערכות ביטוי תא חופשי אחרות. גם מערכות ביטוי תא חופשי אלה יכולים לשמש ביישומי אפיון אבחון וחלבון כגון מערכי מיקרו 30. שורות תאי הלה הפופולריות הן בשימוש נרחב ביותר לבצע את הביטוי של חלבונים 33. Reticulum endoplasmic בשורות תאי הלה אינו מפותח, שהוביל להיעדרות של פעילות שינוי glycosylation לאחר translational 33. עם זאת, הוא האמין במערכת זו כדי להיות יתרון עבור סינתזת חלבון Plasmodium כPlasmodium גם חסר שינוי תרגום ההודעה glycosylation 29. פרוטוקול תמלול בתרגום החופשי תא הלה הוא קל לביצוע, לא יקר ויכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים בדקות 90, מוכן לטיהור ויישומים נוספים במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעדים החשובים לביטוי מוצלח של חלבונים באמצעות שני צעד במערכת המבחנה תא אנושי חופשית ביטוי וטיהור הם: 1) הגברה ושיבוט של גנים לתוך וקטור פלסמיד pT7CFE-CHis מוצלחות; 2) לתעתוק RNA ליום 30 בC o; 3) תרגום של חלבון על 30 מעלות צלזיוס בנוכחות מעכב RNAse; 4) פיתוח פרוטוקול טיהור הזיקה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
References
- Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. . Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
