की अभिव्यक्ति के लिए HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम<em> प्लाज्मोडियम</em> Rhoptry प्रोटीन
Summary
सेल आधारित प्रणालियों में मलेरिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति चुनौती बनी हुई है। हम HELA कोशिकाओं से मलेरिया पुनः संयोजक rhoptry प्रोटीन व्यक्त करने के लिए दो कदम और (इन विट्रो अनुवाद में) एक कदम IVT सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम प्रदर्शित करता है। हम rhoptry प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक नी राल आत्मीयता आधारित शोधन प्रणाली का उपयोग करें।
Abstract
मलेरिया महत्वपूर्ण वैश्विक रुग्णता और मृत्यु का कारण बनता है। कोई नियमित टीका वर्तमान में उपलब्ध है। एक वैक्सीन की कमी के लिए प्रमुख कारणों में से एक उपयुक्त वैक्सीन उम्मीदवारों की पहचान करने की चुनौती है। मलेरिया प्रोटीन प्रोकार्योटिक और यूकेरियोटिक सेल आधारित अभिव्यक्ति सिस्टम खराब कम प्रतिरक्षाजनकता के लिए अग्रणी अनुचित तह, आम तौर पर अघुलनशील ग्लाइकोसिलेटेड और गुजरना कर रहे हैं का उपयोग करते हुए व्यक्त किया। गेहूं के बीज, खरगोश reticulocyte lysate और Escherichia कोलाई lysate सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम वर्तमान में मलेरिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, अभिव्यक्ति समय और प्रोटीन के अनुचित ग्लाइकोसिलेशन की लंबाई अभी भी एक चुनौती बनी हुई है। हम "इन विट्रो में मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम" करार दिया HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली, का उपयोग करने के लिए इन विट्रो में प्लाज्मोडियम प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है। 2 HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणालियों 75 मिनट और transcrib के 3 μl में mRNA टाइपएड mRNA के 90 मिनट में प्रोटीन का अनुवाद करने के लिए पर्याप्त है। 1-कदम अभिव्यक्ति प्रणाली एक प्रतिलेखन और अनुवाद युग्मित अभिव्यक्ति प्रणाली है; प्रतिलेखन और सह अनुवाद 3 घंटा में होता है। प्रक्रिया भी अतिरिक्त ऊर्जा प्रदान करके 6 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है। 2-चरण अभिव्यक्ति प्रणाली में, mRNA के पहले लिखित है और फिर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुवाद मिश्रण में जोड़ा। हम मलेरिया प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कैसे का वर्णन; एक हाइड्रोफोबिक PF3D7_0114100 Maurer की फांक – 2 ट्रांसमेम्ब्रेन (PfMC-2TM) प्रोटीन, एक हाइड्रोफिलिक PF3D7_0925900 प्रोटीन और HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग प्रोटीन PF3D7_1361800 युक्त एक Armadillo दोहराता है। प्रोटीन 2-कदम और 1-कदम अभिव्यक्ति की रणनीतियों को रोजगार सूक्ष्म मात्रा में व्यक्त कर रहे हैं। एक आकर्षण शोधन विधि भी वर्णन किया गया है इन विट्रो में मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए व्यक्त प्रोटीन के 25 μl शुद्ध करने के लिए। प्रोटीन उपज ब्रैडफोर्ड परख द्वारा निर्धारित किया जाता है और व्यक्तऔर शुद्ध प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण से इसकी पुष्टि की जा सकती है। अभिव्यक्त किए जाते हैं पुनः संयोजक प्रोटीन टीकाकरण, immunoassays और प्रोटीन अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
मलेरिया अनुसंधान में, प्रोकार्योटिक या यूकेरियोटिक सेल आधारित सिस्टम का उपयोग कर immunogenic प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक चुनौती बनी हुई है। प्लाज्मोडियम जीनोम और अज्ञात पद अनुवादकीय तंत्र 14,7, एटी समृद्धि एंटीबॉडी उत्पादन और टीका के अध्ययन के लिए ठीक से मुड़ा और immunogenic प्रोटीन प्राप्त करने के साथ जुड़े कठिनाइयों के लिए योगदान करते हैं। ऐसे Escherichia कोलाई के रूप में प्रोकार्योटिक सिस्टम पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रोकार्योटिक प्रणाली, प्रभावी, कम लागत पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार का उत्पादन और कई क्लोनिंग वैक्टर है। ई मेजबान कोलाई कोशिकाओं को बदलने के लिए आसान कर रहे हैं और कोशिकाओं में तेजी से बढ़ता है। हालांकि, प्रोकार्योटिक सिस्टम ऐसे एमिनो एसिड प्रतिस्थापन, बाद translational संशोधन, शामिल किए जाने के शव 24 घंटे के अंदर संदूषण, विषम उत्पादों और पुनः संयोजक प्रोटीन का संचय के जोखिम की कमी के रूप सीमाएं हैं।
मेंMehlin एट अल द्वारा अध्ययन। (2006), 1000 खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) व्यक्त किया गया। व्यक्त प्रोटीन की लगभग 7% घुलनशील 14 थे। मनाया जटिलता जीनों के पक्षपाती प्रकृति और अमीर जीनोम 14 में प्लाज्मोडियम द्वारा आदर्श रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं कि codons के उच्च आवृत्ति की वजह से है। इस समस्या को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति plasmids या दुर्लभ codons या आवृत्तियों 3 से मेल खाने वाले codons समझते हैं कि tRNAs युक्त मेजबान कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया है। यहां तक कि इन अनुकूलन प्रदर्शन के बाद, प्रोटीन के बहुत छोटे हिस्से, घुलनशील सक्रिय और 14 immunogenic के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम ऐसे राइबोसोम, दीक्षा कारकों, बढ़ाव कारकों (अनुवाद कारकों), tRNA और अमीनोएसिल-टीआरएनए synthetases रूप प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए सभी आवश्यक घटक होते हैं। दोनों प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं से एक कदम प्रक्रिया 11,29 में मिलकर कर रहे हैं। transcrimRNA की उचित मात्रा में एक अलग ट्यूब 11,29 में अनुवाद मशीनरी के साथ incubated है पहले ption प्रतिक्रिया एक ट्यूब में किया जाता है। इन तरीकों प्लाज्मोडियम सपा। प्रोटीन की अभिव्यक्ति करने में सफल रहे हैं, एक बड़ी खामी लगभग 22 घंटा 29 है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए समय की लंबाई है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल 29 में शामिल करने के लिए आपूर्ति की उच्च लागत, घटक तैयारी में श्रम प्रधान सेल lysate की तैयारियाँ और विसंगतियों, इन पद्धतियों अप्राप्य बनाने के। एक सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली के विकास के लिए शोधकर्ताओं का मुख्य फोकस ऐसे तेजी से आनुवंशिक संशोधन, उच्च सांद्रता और सीधे आगे lysate तैयारियों 1 के साथ तेजी से पैदावार जैसे कारकों पर निर्भर करता है।
ऐसे खमीर, स्तनधारी सेल लाइनों, baculovirus मध्यस्थता अभिव्यक्ति प्रणाली, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum और परजीवी अभिव्यक्ति सिस्टम सु के रूप में यूकेरियोटिक सिस्टमलीशमैनिया के रूप में चर्चा पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 7 के लिए इस्तेमाल किया गया है। यूकेरियोटिक सिस्टम वंशावली रिश्ते का हिस्सा है और इसलिए भी इस तरह के ग्लाइकोसिलेशन, acylation, डाइसल्फाइड बंधन गठन, निगरानी बातचीत, प्रोटियोलिसिस और उप सेलुलर compartmentalization के रूप में विशेषताओं का हिस्सा। यूकेरियोट्स में प्रोटीन का स्राव घटनाओं संचय को रोकने और अभिव्यक्ति सिस्टम 13 के लिए विषाक्तता कम हो जाती है। वे बड़े पैमाने में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए और उच्च पैदावार 4 प्राप्त करने के लिए उपयुक्त हैं के रूप में खमीर प्रणाली के उपयोग को प्राथमिकता दी जाती है। दो पी फाल्सीपेरम प्रोटीन PfCP-29 और Pvs25 खमीर प्रणाली 4 का उपयोग कर उत्पादन किया गया था। हालांकि, प्रोटीन के अधिकांश के संश्लेषण में एक बड़ी खामी अनियमित और एन ओ-ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न, अनुचित तह और उनके मूल रूप में 4 से प्रोटीन की काट-छांट था।
पुनः संयोजक प्रोटीन के संश्लेषण के लिए स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग के श्रम प्रधान है और यह खर्च कर रहा हैस्थिर पुनः संयोजक सेल लाइनों 4 बनाए रखने के लिए निर्णायक। इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन संकेतन, प्रोटीन बातचीत और परजीवी मेजबान बातचीत के विश्लेषण के लिए सीमित किया गया है और यह भी डीएनए टीके 4 के परीक्षण के लिए। इस के साथ साथ वर्णित मानव डीएनए और mRNA में इन विट्रो प्रोटीन अभिव्यक्ति सेल मुक्त प्रणाली 3 घंटा में प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक HeLa सेल व्युत्पन्न स्तनधारी आधारित प्रणाली है। प्रोटीन की पहचान और शुद्धि की सुविधा एक सी टर्मिनल टैग pT7CFE1-chis अभिव्यक्ति वेक्टर है का उपयोग करते हुए व्यक्त किया। HeLa आधारित प्रणाली है, जिससे अनुवाद प्रणाली की दक्षता बढ़ाने, अनुवाद दीक्षा कारकों और एक अनुवाद नियामक के साथ पूरक है। प्रोटीन तेजी से अनुवादित जांच की, और सत्यापित विभिन्न immunologic और संरचनात्मक अनुप्रयोगों के 15 में इस्तेमाल के लिए कार्रवाई की जा सकती।
ऐसे गेहूं के बीज और खरगोश reticulocyte के रूप में यूकेरियोटिक सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम वर्तमान में वर की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता हैप्लाज्मोडियम प्रोटीन 11,29 सहित ious यूकेरियोटिक प्रोटीन। इसके अलावा, ई कोलाई आधारित सेल मुक्त सिस्टम भी यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कार्यरत हैं 11। 1 टेबल सिस्टम की सुविधाओं के साथ ही प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सिस्टम का उपयोग की आसानी तुलना द्वारा अलग सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम का सार। दूसरों की तुलना में मानव कोशिका मुक्त प्रणाली पोस्ट और सह translational संशोधनों प्रदर्शन करने की क्षमता है और कम खर्चीला है। कोडोन अनुकूलन संभव है और सभी प्रतिक्रियाओं 3 घंटा में प्रदर्शन किया जा सकता है। HeLa प्रणाली प्रयोगशाला स्थापित करने में प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक आदर्श अनुवाद प्रणाली है।
अन्य सेल मुक्त प्रणालियों पर मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों का एक प्रमुख लाभ विभिन्न अंगों और ऊतकों से निकाली गई कई अलग अलग सेल लाइनों की उपलब्धता है। सेल मुक्त सिस्टम की कई किस्में सेल लाइन के आधार पर बनाया जा सकता है। उद्धरणस्तनधारी कोशिकाओं से व्युत्पन्न किसी भी अन्य सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में बड़े प्रोटीन के संश्लेषण के लिए उच्च क्षमता है। ये सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम भी इस तरह के सूक्ष्म सरणियों के रूप में 30 नैदानिक और प्रोटीन लक्षण वर्णन अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। लोकप्रिय HeLa सेल लाइनों के सबसे व्यापक रूप से प्रोटीन 33 की अभिव्यक्ति के लिए बाहर ले जाने के लिए उपयोग किया जाता है। HeLa सेल लाइनों में अंतःप्रद्रव्य जालिका बाद translational ग्लाइकोसिलेशन संशोधन गतिविधि 33 की अनुपस्थिति के लिए अग्रणी, अविकसित है। हालांकि, इस प्रणाली प्लाज्मोडियम भी ग्लाइकोसिलेशन पद अनुवाद संशोधन 29 का अभाव के रूप में प्लाज्मोडियम प्रोटीन संश्लेषण के लिए फायदेमंद माना जा रहा है। HeLa सेल मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्रोटोकॉल सस्ती, प्रदर्शन करने के लिए आसान है और प्रोटीन शुद्धि और आगे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार है, 90 मिनट में व्यक्त किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धि में दो कदम का उपयोग प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) सफल प्रवर्धन और pT7CFE-chis प्लाज्मिड वेक्टर में जीन की क्लोनिंग; 2) 30 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.
Materials
| Two-step in vitro human cell free expression system | Thermo fischer | 88856 | Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| One-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80oC. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at room temperature |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4oC. |
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