الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
نقل بالتبني من الخلايا T الممرض محددة يمكن استخدامها لمنع وعلاج الأمراض الانتهازية مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى التي تحدث بعد خيفي المكونة للدم زرع الخلايا الجذعية. خلايا T الفيروسية محددة من الجهات المانحة خيفي، بما في ذلك الجهات المانحة طرف ثالث، يمكن نشر السابقين الجسم الحي في الامتثال مع الممارسة الحالية التصنيع الجيدة (المركب)، وتوظيف الجولات المتكررة من التحفيز يحركها مستضد لنشر انتقائي خلايا T المطلوب. ويمكن أيضا أن تضطلع تحديد وعزل الخلايا T مستضد معين بناء على نظام التقاط خلوى الخلايا T التي تم تفعيلها لإفراز الإنترفيرون جاما (IFN-γ). ومع ذلك، التطبيق البشري على نطاق واسع للنظام التقاط خلوى (CCS) للمساعدة في استعادة الحصانة كانت محدودة لأن عملية إنتاج تستغرق وقتا طويلا وتتطلب مشغل المهرة. تطوير جهاز لتخصيب الخلية الجيل الثاني مثل CliniMACS معجزة الآنتمكن المحققون على توليد خلايا T الفيروسية محددة باستخدام، أقل النظام كثيفة العمالة الآلي. هذا الجهاز يفصل صفت مغناطيسيا الخلايا من الخلايا غير المسماة باستخدام المغناطيسية تنشيط الخلايا التكنولوجيا الفرز لتوليد المنتجات السريرية الصف، كما تم تصميم نظام مغلق ويمكن الوصول إليها وتعمل على الفوق. ونحن لشرح تشغيل هذا الجهاز الجديد لتخصيب الخلية الآلي لتصنيع خلايا T pp65 محددة CMV تم الحصول عليها من المنتج فصادة الحالة المستقرة التي تم الحصول عليها من متبرع مصاب بالفيروس المضخم للخلايا. ويمكن بعد ذلك هذه الخلايا T معزولة أن غرست مباشرة إلى المريض تحت الإشراف التنظيمي المؤسسي والاتحادي. كل الخطوات لمعالجة الحيوية بما في ذلك إزالة خلايا الدم الحمراء، ومؤتمتة بالكامل تحفيز خلايا T، وفصل الخلايا مستضد معين T، وتنقية، والغسيل. الأجهزة مثل هذه تثير احتمال أن خلايا T للتطبيق البشري يمكن تصنيعها خارج مخصصة الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) أن تنتج المرافق وبدلا من ذلك في التسهيلات المصرفية الدم حيث يمكن للموظفين الإشراف بروتوكولات الآلي لإنتاج منتجات متعددة.
Introduction
للدم زرع الخلايا الجذعية (HSCT) 1 يمكن الجمع بين العلاج T-خلية بالتبني لتحسين الطعم ضد الورم تأثير وتوفير الحصانة للعدوى الانتهازية 2. جيل من الخلايا T-المستمدة المانحة مستضد معين للتسريب قد تطلبت من الناحية التاريخية الموظفين المهرة واستخدام المرافق المتخصصة التي GMP المتوافقة. وقد نتج عن تسليم مثل هذه الخلايا T في القرار من العدوى الانتهازية 3 وكذلك علاج الورم الخبيث الكامن 4. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت المحققين أن نقل بالتبني من بضعة آلاف فقط خلايا T الفيروس محددة (~ 1 × 10 4-2،5 × 10 5 خلايا / كغم من وزن الجسم المتلقي) يمكن علاج الالتهابات الانتهازية CMV بعد خيفي HSCT 5-9 بنجاح. وهناك عدد محدود من مرافق GMP بما يرتبط بها من متطلبات التصنيع الماهرة والتكلفة العالية المرتبطة بإنتاج الخلايا ومع ذلك، فقد restricted وصول المريض إلى اعدا العلاجات T-10 خلية. ويستند نهج واحد لعزل خلايا T مستضد معين على CCS باستخدام كاشف ثنائية محددة للاعتراف CD45 وIFN-γ. كما هو مبين، هذه المنهجية يمكن استخدامها لتوليد السريرية الصف CMV محددة خلايا T توظيف مؤتمت الجهاز CCS تخصيب الخلية (الشكل 1B).
يتم إنشاء خلايا T CMV الخاصة التي يحتضنها الببتيدات متداخلة من CMV pp65 المستضد مع مجموع الخلايا فصادة الكريات البيض النووية (TNC) من المانحين CMV-مصليا. هذه الببتيدات، المعروضة في سياق الكريات البيض مستضد البشرية (HLA)، وتفعيل خلايا T CMV pp65 محددة داخل المجلس الوطني الانتقالي لإفراز الإنترفيرون γ. هذه الخلايا T ويمكن بعد ذلك أن "القبض" وفصل مغناطيسيا. تشغيل الجهاز من الجيل الأول لتخصيب الخلية (الشكل 1A) المطلوبة الموظفين المهرة في زراعة الخلايا في ظل ظروف GMP، والتنسيق من الموظفين للقيام ليالي متعددةteps اللازمة لتوليد منتج "القبض".
الإجراء المطلوب عادة 10-12 ساعة من العمل المتواصل، وبالتالي من المرجح الموظفين بحاجة إلى العمل على فترتين في منشأة GMP. ويتجنب هذه القيود الآن من تنفيذ جهاز الجيل الثاني (هو مبين في الشكل 1B). يتعهد هذا الجهاز تخصيب المغناطيسي، مماثل لجهاز الجيل الأول، ولكن بأتمتة جوانب أخرى من قانون الأحوال المدنية في نهج unbreached. هذا يخفف كثيرا من عبء على الفريق GMP لأن معظم الخطوات التي يمكن أن يتحقق دون مراقبة من قبل الموظفين. وعلاوة على ذلك، لأن الجهاز يعمل كنظام مغلق، وخلايا T مستضد معين يمكن الحصول عليها ومعالجتها على الفوق باستثناء الخطوات المتبعة في عزلة فصادة الكريات البيض وإعداد المواد قبل البدء في الصك. وقد حانة تفاصيل الأجهزة كاملة وظيفة هذا الجهاز تخصيب الخلية الجيل الثانيأسسنا 11.
هنا، نحن تصف الخطوات لإثراء CMV خلايا T pp65 محددة من منتج فصادة الحالة المستقرة باستخدام نظام CCS تخصيب الخلية الآلي. معزولة مرة واحدة، وهذه الخلايا T-CMV محدد قد غرست مباشرة إلى المريض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد برز العلاج T-خلية بالتبني كخيار قابل للتطبيق لعلاج الأورام الخبيثة B-الخلية 4. إمكانات علاجية تعتمد على غرس العدد المطلوب من الخلايا T محددة المستضد الهدف التي تفتقر تنسخي الشيخوخة 2. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الفصل بين السكان نقية من خلايا T معينة مستضد من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
