As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
A transferência adoptiva de células T específica de agentes patogénicos podem ser utilizados para prevenir e tratar infecções oportunistas, tais como o citomegalovírus (CMV) que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Células virais T específicas de dadores alogénicos, incluindo os doadores de terceiros, podem ser propagadas ex vivo em conformidade com as boas práticas de fabrico corrente (cGMP), empregando ciclos repetidos de estímulo-driven antígeno para propagar selectivamente as células T desejados. A identificação e isolamento de células T específicas de antigénio pode também ser realizada com base no sistema de captura de citoquinas de células T que foram activadas para secretar gama-interferão (IFN-γ). No entanto, a aplicação humana generalizada do sistema de captura de citocinas (CCS) para ajudar a restaurar a imunidade tem sido limitado como o processo de produção é demorada e requer um operador qualificado. O desenvolvimento de um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração, como Prodigy CliniMACS agorapermite investigadores para gerar células T-virais específico usando um, menos sistema de trabalho intensivo automatizado. Este dispositivo separa magneticamente marcada células a partir de células não marcadas usando tecnologia de células activadas por triagem magnética para gerar produtos de grau clínico, foi concebido como um sistema fechado, e pode ser acedido e é operado na bancada. Nós demonstramos o funcionamento deste novo dispositivo de enriquecimento de células automatizado para a fabricação de células T específicas para CMV pp65 obtidos a partir de um produto de aférese steady-state obtidas a partir de um dador seropositivo a CMV. Estas células T isolados podem então ser directamente injectado a um doente sob a supervisão regulamentar e institucional federal. Todos os passos de processamento de bio incluindo a remoção de células vermelhas do sangue, a estimulação de células T, separação das células T específicas de antigénio, purificação e lavagem estão completamente automatizado. Dispositivos como este levantam a possibilidade de que as células T para aplicação em seres humanos pode ser produzido fora da boa prática de fabrico dedicada (GMP) Instalações e em vez disso ser produzido em instalações bancárias de sangue onde os funcionários podem supervisionam protocolos automatizados para produzir vários produtos.
Introduction
-Transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) 1 pode ser combinada com a terapia adoptiva de células T para melhorar o efeito do enxerto contra o tumor e para proporcionar imunidade a infecções oportunistas 2. Geração de células derivadas do doador T específicas de antigénio para perfusão tem historicamente exigido pessoal qualificado e uso de instalações especializadas que são GMP-compliant. A entrega dos referidos células T resultou na resolução de infecções oportunistas 3, bem como o tratamento da doença subjacente 4. Recentemente, os investigadores demonstraram que a transferência adoptiva de apenas alguns milhares de células T específicas do vírus (1 x 10 ~ 4 – 5 2,5 x 10 células / kg de peso corporal do receptor) podem tratar com sucesso infecções oportunistas CMV após transplante alogénico 5-9. Um número limitado de instalações GMP com requisitos de fabrico associados especializados e o custo elevado associado com a produção de células tem, no entanto, restro acesso dos doentes a terapias promissoras icted de células T 10. Uma abordagem para o isolamento de células T específicas de antigénio é calculada com base nos CAC usando um reagente bi-específico para reconhecer CD45 e IFN-γ. Como é mostrado, esta metodologia pode ser utilizada para gerar células T específicas para CMV grau clínico que empregam um dispositivo de enriquecimento de células CCS automatizado (Figura 1B).
Células específicas do CMV T são geradas por incubação de péptidos sobrepostos de antígeno pp65 do CMV com o total de células nucleares leucoferese (TNC) de doadores CMV-soropositivos. Estes péptidos, apresentados no contexto do antigénio dos leucócitos humanos (HLA), activar as células T específicas de pp65 de CMV dentro da TNC a secretar IFN-γ. Estas células T podem então ser "capturados" e separado magneticamente. O funcionamento do dispositivo de enriquecimento de células de primeira geração (Figura 1A), exigiam pessoal especializado em cultura de células em condições GMP, e coordenação de pessoal para realizar as múltiplas sTEPS necessário para gerar um produto "capturado".
O procedimento normalmente necessários de 10 a 12 horas de operação contínua, e, portanto, o pessoal provavelmente precisará trabalhar mais de dois turnos nas instalações GMP. Estas restrições são agora obviado pela aplicação de um dispositivo de segunda geração (mostrado na Figura 1B). Este dispositivo realiza enriquecimento magnético, semelhante ao primeiro dispositivo de geração, mas automatiza outros aspectos do CCS em uma abordagem unbreached. Isto reduz significativamente a carga sobre a equipe GMP como a maioria dos passos pode ser realizado por uma equipe autônoma. Além disso, uma vez que o dispositivo funciona como um sistema fechado, as células T específicas de antigénio pode ser capturado e processado na bancada excepto as etapas envolvidas no isolamento leucaferese e preparação dos materiais de partida antes de o instrumento. Detalhes da instrumentação completa e funcionalidade deste dispositivo enriquecimento celular de segunda geração foram pubcido 11.
Aqui, descrevemos os passos para enriquecer células específicas do CMV pp65 T a partir de um produto de aférese de estado estacionário com o sistema automatizado CCS enriquecimento celular. Uma vez isoladas, estas células T específicas de CMV pode ser imediatamente infundidas num paciente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapia adoptiva de células T tem emergido como uma opção viável para o tratamento de malignidades de células-B 4. O seu potencial terapêutico é dependente infundindo o número desejado de células T específicas para o antigénio alvo que carecem de senescência replicativa 2. Isto pode ser conseguido, classificando uma população pura de células T específicas de antigénios a partir de células T expandidas de acordo com as boas práticas de fabrico actuais. Dois procedimentos de triage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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