Cellules T d'enrichissement de cellules automatisé de cytomégalovirus spécifique pour des applications cliniques utilisant le système de capture de cytokine
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de l'agent pathogène peut être utilisé pour prévenir et traiter les infections opportunistes telles que le cytomégalovirus (CMV) survenant après allogéniques hématopoïétiques transplantation de cellules souches. Cellules T virales spécifiques de donneurs allogéniques, y compris les bailleurs de fonds tiers, peuvent être propagés ex vivo en conformité avec les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), employant des cycles répétés de stimulation conduit antigène pour propager sélectivement les cellules T souhaités. L'identification et l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène peuvent également être effectuées sur la base du système de capture de cytokine des cellules T qui ont été activées pour sécréter de l'interféron-gamma (IFN-γ). Cependant, l'application humaine généralisée du système cytokine de capture (CCS) pour aider à rétablir l'immunité a été limitée que le processus de production prend du temps et nécessite un opérateur qualifié. Le développement d'un dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération tels que CliniMACS Prodigy maintenantpermet aux enquêteurs de générer des cellules T-viraux spécifiques en utilisant un système de main-d'œuvre moins automatisé. Ce dispositif sépare magnétiquement marqué cellules de cellules non marquées à l'aide de la technologie de tri activé magnétique de cellules pour générer des produits de qualité clinique, est conçu comme un système fermé et peut être consulté et utilisé sur la paillasse. Nous démontrons le fonctionnement de ce nouveau dispositif d'enrichissement de cellules automatisé pour la fabrication de cellules T spécifiques de pp65 CMV obtenus à partir d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre obtenu à partir d'un donneur séropositif CMV. Ces cellules T isolées peuvent ensuite être directement perfusé à un patient sous la supervision réglementaire et institutionnel fédéral. Toutes les étapes de traitement, y compris la bio-élimination des cellules rouges du sang, la stimulation des cellules T, la séparation des cellules T spécifiques de l'antigène, la purification et le lavage sont entièrement automatisés. Les dispositifs tels que ce soulèvent la possibilité que les cellules T pour application humaine peuvent être fabriqués à l'extérieur de bonnes pratiques de fabrication dédié (GMP) Et des installations au lieu être obtenus dans des installations bancaires de sang où le personnel peut superviser les protocoles automatisés pour produire des produits multiples.
Introduction
Hématopoïétiques transplantation de cellules souches (HSCT) 1 peut être combiné avec la thérapie des cellules T adoptive pour améliorer l'effet du greffon contre la tumeur et de fournir l'immunité aux infections opportunistes 2. Génération de cellules T donateurs dérivés spécifiques de l'antigène pour perfusion a historiquement nécessaire du personnel et l'utilisation des installations spécialisées qui sont conformes aux BPF qualifiés. La livraison de ces cellules T a abouti à la résolution des infections opportunistes 3 ainsi que le traitement de la maladie sous-jacente 4. Récemment, des chercheurs ont démontré que le transfert adoptif de seulement quelques milliers de cellules T spécifiques du virus (~ 1 x 10 4 à 2,5 x 10 5 cellules / kg de poids corporel du receveur) peuvent réussir à traiter les infections à CMV opportunistes après allogéniques HSCT 5-9. Un nombre limité d'installations GMP aux exigences de fabrication qualifiés associés et le coût élevé associé à la production de cellules a, cependant, restrl'accès des patients à des thérapies prometteuses igés cellules T 10. Une approche pour isoler des cellules T spécifiques d'antigène est basée sur le CCS en utilisant un réactif bi-spécifique pour reconnaître CD45 et IFN-γ. Comme on le voit, cette méthodologie peut être utilisée pour générer des cellules T spécifiques de CMV de qualité clinique utilisant un dispositif d'enrichissement de cellules automatisé CCS (figure 1B).
Des cellules T spécifiques de CMV sont générés par incubation de peptides chevauchants à partir de l'antigène pp65 de CMV avec des cellules de leucaphérèse totales (TNC) nucléaires provenant de donneurs CMV-séropositif. Ces peptides, affichés dans le contexte de l'antigène de leucocyte humain (HLA), activent les cellules T spécifiques de CMV pp65 au sein du TNC à sécréter IFN-γ. Ces cellules T peuvent alors être "capturés" et séparées magnétiquement. Le fonctionnement du dispositif d'enrichissement de cellules de première génération (figure 1A) requis personnel qualifié dans la culture cellulaire dans des conditions GMP, et la coordination du personnel pour entreprendre les multiples sTeps nécessaire pour générer un produit "capturé".
La procédure généralement requis 10 à 12 h de fonctionnement continu, et donc le personnel probablement besoin de travailler sur deux quarts de travail dans l'établissement GMP. Ces contraintes sont désormais évités par la mise en œuvre d'un dispositif de deuxième génération (le montre la figure 1B). Ce dispositif engage enrichissement magnétique, similaire au premier dispositif de génération, mais automatise les autres aspects de la SCC dans une approche unbreached. Cela réduit considérablement le fardeau de l'équipe GMP que la plupart des étapes peut être accompli sans surveillance par le personnel. En outre, puisque le dispositif fonctionne comme un système fermé, les cellules T spécifiques de l'antigène peuvent être capturées et traitées sur la paillasse à l'exception des étapes impliquées dans l'isolement de leucaphérèse et préparation des matières de départ avant de l'instrument. Détails de l'instrumentation complète et la fonctionnalité de ce dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération ont été pubblies 11.
Ici, nous décrivons les étapes pour enrichir les cellules T spécifiques de pp65 CMV d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre en utilisant le système de CCS d'enrichissement de cellules automatisé. Une fois isolé, ces cellules T spécifiques de CMV peuvent être immédiatement perfusé dans un patient.
Protocol
Representative Results
Discussion
La thérapie des cellules T adoptive a émergé comme une option viable pour traiter les tumeurs malignes à cellules B 4. Son potentiel thérapeutique dépend de l'infusion le nombre désiré de cellules T spécifiques de l'antigène cible sénescence réplicative qui manquent deux. Ceci peut être obtenu par le tri d'une population pure de cellules T spécifiques de l'antigène de lymphocytes T expansés en conformité avec les pratiques de fabrication actuelles bons. Deux procéd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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