Summary

サイトカインキャプチャシステムを用いた臨床応用のためのサイトメガロウイルス特異的T細胞の自動化された細胞濃縮

Published: October 05, 2015
doi:

Summary

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Abstract

病原体特異的T細胞の養子移入は、同種造血幹細胞移植後に発生するサイトメガロウイルス(CMV)感染症などの日和見感染症を予防および治療するために使用することができます。第三者ドナーを含む同種異系のドナーからのウイルス特異的T細胞は、選択的に、所望のT細胞を増殖するための抗原駆動型の刺激の繰り返しのラウンドを用いて、現在の適正製造基準(cGMPの)に準拠してエクスビボで増殖させることができます。抗原特異的T細胞の同定および単離はまた、γ-インターフェロン(IFN-γ)を分泌するように活性化されたT細胞のサイトカイン捕捉システムに基づいて行うことができます。製造プロセスは、時間がかかり、熟練したオペレータを必要とするが、免疫を回復するのに役立つサイトカイン捕獲システム(CCS)の広範なヒトの適用が制限されています。現在、CliniMACSプロディジーなどの第二世代の細胞濃縮装置の開発自動化され、より少ない労働集約システムを使用してウイルス特異的T細胞を生成するための研究を可能にします。このデバイスは、磁気的、臨床グレードの製品を生成するために、磁気活性化細胞選別技術を用いて、非標識細胞から細胞を分離する標識された、閉じたシステムとして設計され、ベンチトップ上でアクセスして操作することができます。我々は、CMV血清反応陽性ドナーから得られた定常状態のアフェレーシス産物から得られたCMVのpp65特異的T細胞を作製するために、この新しい自動化された細胞濃縮装置の動作を示します。これらの単離されたT細胞は、直接機関と連邦規制監督下で患者に注入することができます。赤血球、T細胞の刺激、抗原特異的T細胞の分離、精製、及び洗浄の除去を含むすべての生物処理工程を完全に自動化されています。このようなデバイスは、ヒト適用のためのT細胞は、専用の適正製造基準(GMPの外で製造することができるという可能性を提起)代わりに、設備やスタッフは、複数の製品を生産するために自動化されたプロトコルを監視することができ、血液銀行施設で製造すること。

Introduction

造血幹細胞移植(HSCT)1は、移植片対腫瘍効果を改善し、日和見感染2に対する免疫を提供するために、養子T細胞療法と組み合わせることができます。注入のための抗原特異的なドナー由来T細胞の生成は、歴史的に熟練者とGMP準拠している専門の施設の使用を必要としてきました。このようなT細胞の送達は、日和見感染症3の解像度と同様に、基礎となる悪性腫瘍4の治療をもたらしました。最近、研究者は実証されているそのわずか数千のウイルス特異的T細胞の養子移入(〜1×10 4から2.5×10 5細胞 / kgを、レシピエントの体重)が正常に同種HSCT 5-9後の日和見のCMV感染症を治療することができます。関連した製造業者の要件にGMP施設の限られた数および細胞の生産に関連する高いコストは、しかしながら、RESTRを有しT細胞療法10を約束に対する患者のアクセスをicted。抗原特異的T細胞を単離するための一つのアプローチは、CD45およびIFN-γを認識する二重特異性試薬を用いてCCSに基づいています。示されているように、この方法は、自動化された細胞濃縮CCS装置( 図1B)を用いた臨床グレードのCMV特異的T細胞を生成するために使用することができます。

CMV特異的T細胞は、CMV血清反応陽性ドナーからの白血球搬出総核細胞(TNC)でのCMVのpp65抗原のオーバーラップペプチドをインキュベートすることにより生成されます。ヒト白血球抗原(HLA)との関連で表示されるこれらのペプチドは、IFN-γを分泌するTNC内のCMVのpp65特異的T細胞を活性化します。これらのT細胞は、その後、「捕捉される」ことと、磁気的に分離することができます。第一世代の細胞濃縮装置の動作( 図1A)は、複数のを行うことGMP条件下で細胞培養での人材を必要とし、スタッフのコーディネート「捕捉された」製品を生成するために必要なTEPS。

手順は、通常、連続運転の10〜12時間を必要とするため、担当者はおそらく、GMP施設で2シフト上で動作する必要があります。これらの制約は、現在( 図1Bに示される)第二世代のデバイスの実装によって回避されます。このデバイスは、最初の生成装置と同等の磁気濃縮を、引き受けるが、unbreachedアプローチで、CCSの他の側面を自動化します。ステップのほとんどは、スタッフが無人達成することができるので、これはかなりのGMPチームの負担を軽減します。デバイスは、閉鎖系として動作するので、さらに、抗原特異的T細胞が捕捉され、機器を起動する前に、白血球搬出単離および材料の製造に含まれる工程を除いて、ベンチトップ上で処理することができます。この第二世代の細胞濃縮装置の完全な計測および機能の詳細については、パブされています11 lished。

ここでは、自動化された細胞濃縮CCSシステムを使用して、定常状態のアフェレーシス産物からのCMVのpp65特異的T細胞を濃縮するための手順について説明します。一旦単離されると、これらのCMV特異的T細胞は、直ちに患者に注入することができます。

Protocol

無菌条件下での材料の作製(材料および装置表を参照してください) (w / v)の最終濃度0.5%までのヒト血清アルブミン(HSA)を補充したPBS / EDTA緩衝液の3 Lを準備します。 臨床グレードの0.9%塩化ナトリウム(NaCl)溶液の1リットルバッグ及びGMPグレードの細胞培養培地の2リットルを調製します。 滅菌水8mlでのCMVのpp65の1バイアルを再構成することによりCMV特異的ペプ…

Representative Results

本研究では、自動化された細胞の濃縮CCSシステムは、CMVのpp65特異的T細胞の自動化生産のために使用しました。 CMV特異的T細胞は、3つの細胞アフェレーシス産物から濃縮しました。定常状態のアフェレーシス産物は、CMV血清陽性ドナーから2時間かけて回収し、10 10合計核細胞(TNC)を生成しました。 10 9 TNCは、その後4時間のCMVのpp65由来ペプチド(60ナノモル)で活性化し、IFN…

Discussion

養子T細胞療法は、B細胞悪性腫瘍4を処置するための実行可能な選択肢として浮上しています。その治療可能性は、複製の老化2を欠く標的抗原特異的T細胞の所望の数の注入に依存します。これは、現在の適正製造基準に準拠して増殖したT細胞の抗原特異的T細胞の純粋な集団を選別することによって達成することができます。二つのソート手順が広く、すなわち、蛍光活性化?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.

Materials

CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 mL Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

References

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Cite This Article
Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

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