Автоматизированная Обогащение Ячейка Цитомегаловирус-специфические Т-клетки для клинического применения с использованием системы цитокинов захвата
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Приемная передача возбудителя конкретных Т-клеток может быть использован для профилактики и лечения оппортунистических инфекций, таких как цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции, происходящие после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Вирусные конкретных Т-клеток из аллогенных доноров, в том числе доноров сторонних, могут распространяться экс естественных условиях в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ), используя повторные раундов антиген-приводом стимуляции выборочно распространяются желаемых Т-клеток. Идентификация и выделение антиген-специфических Т-клеток может быть также проведена на основе системы захвата цитокинов Т-клеток, которые были активированы секретировать гамма-интерферона (IFN-gamma). Тем не менее, широко распространены человека применение системы захвата цитокинов (CCS), чтобы помочь восстановить иммунитет был ограничен, как производственный процесс занимает много времени и требует квалифицированного оператора. Развитие устройство обогащения клеток второго поколения, таких как CliniMACS Prodigy Сейчаспозволяет следователям генерируют вирусных конкретных Т-клеток, используя автоматизированную, менее трудоемким систему. Это устройство отделяет магнитно меченых клеток из клеток с использованием немеченых магнитного активированного технологии сортировки клеток для создания клинико-класса продуктов, спроектирована как закрытая система, и могут быть доступны и работают по крышке. Мы демонстрируем действие этого нового устройства автоматизированного обогащения клеток для производства CMV РР65-специфических Т клеток, полученных из стационарного афереза продукта, полученного из ЦМВ серопозитивным донора. Эти изолированные Т-клетки могут быть непосредственно вливаются в пациента под институциональной и федерального регулирующего надзора. Все стадии био-обработки, включая удаление эритроцитов, стимуляция Т-клеток, разделения антиген-специфических Т-клеток, очистки и промывки полностью автоматизированы. Такие устройства, как это повышает вероятность, что Т-клетки для человека применения могут быть изготовлены за пределами посвященной надлежащей производственной практики (GMP) Средства и вместо быть произведены в банковских услуг крови, где сотрудники могут контролировать автоматизированные протоколы, чтобы произвести несколько продуктов.
Introduction
Трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 1 могут быть объединены с приемной терапии Т-клеток, чтобы улучшить трансплантат против опухоли эффект и обеспечить устойчивость к оппортунистических инфекций 2. Генерация антигенспецифических доноров полученных Т-клеток для инфузий исторически требуется квалифицированный персонал и использование специализированных объектов, которые GMP-совместимый. Доставка таких Т-клеток привела к решению оппортунистических инфекций 3, а также в лечении основного злокачественности 4. Недавно исследователи показали, что усыновитель перевод только несколько тысяч вирусспецифических Т-клеток (~ 1 х 10 4 – 2,5 х 10 5 клеток / кг массы тела получатель) может успешно лечения оппортунистических инфекций ЦМВ после аллогенной HSCT 5-9. Ограниченное число GMP объектов с соответствующими квалифицированных производственных требований и высокая стоимость, связанная с производством клеток, однако, Ограничicted доступ пациента обещая Т-клеточной терапии 10. Один из подходов к выделению антиген-специфических Т-клеток основан на CCS с помощью би-специфическим реагентом распознавать CD45 и IFN-gamma. Как показано, эта методика может быть использована для генерации клинико-класса CMV-специфичные Т-клетки, использующие автоматический CCS обогащение клеток устройство (Фигура 1В).
CMV-специфические Т-клетки генерируются путем инкубации перекрывающихся пептидов из ЦМВ РР65 антигена с лейкафереза общего ядерных клеток (ТНК) из ЦМВ серопозитивных доноров. Эти пептиды, отображаемые в контексте человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), активировать ЦМВ РР65-специфических Т клеток в ТНК секретируют IFN-gamma. Эти Т-клетки могут быть "захвачены" и магнитно разделены. Работа устройства по обогащению первого поколения клеток (1А) требуется персонал квалифицированных в культуре клеток в условиях GMP, и координация персонала для проведения многочисленных SТЭЦ необходимо сформировать "захваченный" продукт.
Процедура обычно требуется от 10 до 12 ч непрерывной работы, и, следовательно, скорее всего, потребуется персонал для работы в течение двух смен на объекте GMP. Эти ограничения в настоящее время устранены путем реализации второго поколения устройства (как показано на фиг.1В). Это устройство осуществляет магнитное обогащение, похожий на устройство первого поколения, но автоматизирует другие аспекты CCS в unbreached подхода. Это значительно снижает нагрузку на команду GMP, как большинство из шагов можно выполнить без присмотра персонала. Кроме того, поскольку устройство действует как замкнутой системе, антиген-специфические Т-клетки могут быть захвачены и обработаны по крышке, кроме операций, связанных с изоляцией лейкафереза и подготовки материалов перед запуском инструмента. Подробная информация о полной приборов и функциональности этого устройства по обогащению клеток второго поколения были пабчания 11.
Здесь мы опишем шаги, чтобы гости чувствовали ЦМВ РР65-специфических Т клеток из стационарного афереза продукта с использованием автоматизированной системы CCS обогащению клеток. После выделения эти CMV-специфические Т-клетки могут быть немедленно вливают пациенту.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приемные терапия Т-клеток стала жизнеспособным вариантом для лечения В-клеточных злокачественных новообразований 4. Его терапевтический потенциал зависит от инфузии нужное количество целевой антиген-специфических Т-клеток, которые не имеют репликативной старение 2. Это м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
