Automatisert Cell anrikning av Cytomegalovirus-spesifikke T-celler for kliniske applikasjoner ved hjelp av cytokin-fangst System
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Adoptiv overføring av patogen-spesifikke T-celler kan brukes til å forebygge og behandle opportunistiske infeksjoner slik som cytomegalovirus (CMV) infeksjoner som forekommer etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon. Virusspesifikke T-celler fra allogene donorer, inkludert tredjeparts givere, kan formeres ex vivo i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practice (cGMP), syssels gjentatte runder med antigen-drevet stimulering til selektivt forplante ønskede T-celler. Identifisering og isolering av antigen-spesifikke T-celler kan også bli foretatt basert på den cytokin capture system av T-celler som er blitt aktivert for å utskille gamma-interferon (IFN-γ). Imidlertid har utbredt human anvendelse av cytokinet fangstsystem (CCS) for å gjenopprette immunitet vært begrenset som produksjonsprosessen er tidkrevende og krever en erfaren operatør. Utviklingen av en andre generasjons mobil berikelse enhet som CliniMACS Prodigy någjør det mulig for forskere å generere viral-spesifikke T-celler ved anvendelse av et automatisert, mindre arbeidskrevende system. Denne enheten skiller magnetisk merket celler fra umerkede celler ved hjelp av magnetisk aktivert celle sortering teknologi for å generere klinisk grad av produkter, er konstruert som et lukket system, og kan nås og drives på benkeplate. Vi viser driften av den nye automatiske celle anrikning anordning for å produsere CMV pp65-spesifikke T-celler oppnådd fra en steady-state-aferese produkt oppnådd fra en CMV-seropositiv giver. Disse isolerte T-celler kan så direkte infundert i en pasient under institusjonell og føderale tilsynet. Alle bio-prosesstrinn, inkludert fjerning av røde blodceller, er stimulering av T-celler, separasjon av antigen-spesifikke T-celler, rensing og vasking helautomatisk. Enheter som dette øke muligheten for at T-celler for mennesker søknad kan produseres utenfor dedikert Good Manufacturing Practice (GMP) Fasiliteter og i stedet bli produsert i blodbankfasiliteter hvor personalet kan føre tilsyn automatiserte protokoller for å produsere flere produkter.
Introduction
Hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT) 1 kan kombineres med adoptive T-celle-terapi for å forbedre graft-versus-tumor effekt og for å tilveiebringe immunitet til opportunistiske infeksjoner 2. Generering av antigen-spesifikke donor-avledet T-celler til infusjon har historisk kreves dyktig personell og bruk av spesialiserte anlegg som er GMP-kompatibel. Leveringen av slike T-celler har resultert i oppløsning for opportunistiske infeksjoner 3, så vel som behandling av den underliggende malignitet 4. Nylig har forskere vist at adoptiv overføring av bare noen få tusen virus-spesifikke T-celler (1 x 10 ~ 4 – 2,5 x 10 5 celler / kg mottakerkroppsvekt) kan med hell å behandle opportunistiske CMV-infeksjoner etter allogen HSCT 5-9. Et begrenset antall GMP anlegg med tilhørende dyktige produksjonskrav og høye kostnader forbundet med celleproduksjon har imidlertid restricted pasienten tilgang til lovende T-cellen terapi 10. En fremgangsmåte for å isolere antigen-spesifikke T-celler er basert på CCS ved hjelp av en bi-spesifikt reagens for å gjenkjenne CD45 og IFN-γ. Som vist, kan denne metode benyttes til å generere klinisk grad av CMV-spesifikke T-celler ved anvendelse av en automatisk celle anrikning CCS-enheten (figur 1B).
CMV-spesifikke T-celler er generert ved inkubering av overlappende peptider fra CMV pp65 antigen med leukaferese totale atom celler (TNC) fra CMV-seropositive givere. Disse peptidene, som vises i sammenheng med human leukocytt antigen (HLA), aktivere CMV pp65-spesifikke T-celler i TNC til å utskille IFN-γ. Disse T-cellene kan deretter bli "fanget" og magnetisk separert. Driften av den første generasjon celle anrikning anordning (figur 1 A) som er nødvendig personell faglærte i cellekultur under GMP forhold, og koordinering av ansatte til å foreta flere sTeps nødvendig for å generere en "fanget" produkt.
Prosedyren vanligvis kreves 10 til 12 timer med kontinuerlig drift, og derfor personell sannsynlig trenger å jobbe i løpet av to skift i GMP anlegget. Disse begrensningene er nå unngås ved gjennomføring av et andre-generasjons anordning (vist i figur 1 B). Denne anordning foretar magnetisk anrikning, lik den første genereringsinnretningen, men automatiserer andre aspekter ved CCS i en unbreached tilnærming. Dette reduserer belastningen på GMP lag som de fleste av trinnene kan oppnås uten tilsyn av ansatte betydelig. Videre, siden anordningen virker som et lukket system, antigen-spesifikke T-celler kan fanges opp og behandlet på Borstemmaskin unntatt trinnene involvert i leukaferese isolering og fremstilling av materialer før instrumentet. Detaljer om komplett instrumentering og funksjonaliteten til denne andre generasjons mobil berikelse enheten har blitt pubblert 11.
Her beskriver vi fremgangsmåten for å berike CMV pp65 spesifikke T-celler fra en steady-state aferese produkt ved hjelp av automatiserte celle berikelse CCS systemet. Når isolert, kan disse CMV-spesifikke T-celler umiddelbart bli infusert inn i en pasient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptiv T-celleterapi har dukket opp som et levedyktig alternativ til å behandle B-cellemaligniteter 4. Dets terapeutiske potensialet er avhengig av å tilføre det ønskede antall mål antigenspesifikke T-celler som mangler replikative senescens 2. Dette kan oppnås ved å sortere ut en ren populasjon av antigenspesifikke T-celler fra ekspanderte T-cellene i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practices. To sorteringsprosedyrer er utbredt, nemlig fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
