Automatiserad cell Anrikning av cytomegalovirus-specifika T-celler för kliniska tillämpningar med hjälp av cytokin-infångningssystemet
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Den adoptiv överföring av patogenspecifika T-celler kan användas för att förhindra och behandla opportunistiska infektioner, såsom cytomegalovirus (CMV) -infektion inträffar efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation. Viral specifika T-celler från allogena givare, däribland tredje part givare kan förökas ex vivo i enlighet med gällande god tillverkningssed (cGMP), som använder upprepade omgångar av antigendriven stimulans för att selektivt propagera önskade T-celler. Identifiering och isolering av antigenspecifika T-celler kan också genomföras baserat på den cytokin infångningssystemet av T-celler som har aktiverats för att utsöndra y-interferon (IFN-γ). Emellertid har utbredd människa av cytokinen capture-system (CCS) för att hjälpa till att återställa immunitet begränsats eftersom tillverkningsprocessen är tidskrävande och kräver en skicklig operatör. Utvecklingen av en andra generationens enhet cell anrikning som CliniMACS Prodigy nugör det möjligt för utredarna att generera virusspecifika T-celler med hjälp av ett automatiserat, mindre arbetsintensiva systemet. Denna anordning separerar magnetiskt märkta celler från omärkta celler med hjälp av magnetisk aktiverad cellsortering teknik för att generera kliniska kvalitet produkter, är konstruerad som ett slutet system och kan nås och drivs på bänk. Vi visar driften av denna nya automatiserade cell anrikning enhet för tillverkning av CMV pp65 specifika T-celler som erhållits från en steady-state aferes produkt som utvinns ur en CMV seropositiv donator. Dessa isolerade T-celler kan sedan direkt infusion i en patient i institutionell och federal tillsyn. Samtliga biologiskt behandlingssteg innefattande avlägsnande av röda blodkroppar, är stimulering av T-celler, separation av antigen-specifika T-celler, rening och tvättning helt automatiserad. Enheter som denna lyfter möjligheten som kan tillverkas T-celler för människa utanför dedikerad god tillverkningssed (GMP) Anläggningar och i stället framställas i blod banktjänster där personalen kan övervaka automatiserade protokoll för att producera flera produkter.
Introduction
Hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) en kan kombineras med adoptiv T-cellsterapi för att förbättra transplantat-mot-tumöreffekten och för att ge immunitet mot opportunistiska infektioner 2. Generering av antigenspecifika givar härledda T-celler för infusion har historiskt krävs kompetent personal och användning av specialiserade anläggningar som är GMP-kompatibel. Leveransen av sådana T-celler har resulterat i upplösning av opportunistiska infektioner 3 samt behandla den underliggande malignitet 4. Nyligen har forskare visat att adoptiv överföring av endast några tusen virusspecifika T-celler (~ 1 x 10 fyra – 2,5 x 10 5 celler / kg av mottagarens kroppsvikt) kan framgångsrikt behandla opportunistiska CMV infektioner efter allogen HSCT 5-9. Ett begränsat antal GMP anläggningar med tillhörande skickliga tillverkningskrav och de höga kostnaderna i samband med cellproduktion har dock restricted patienternas tillgång till lovande T-cellterapi 10. Ett tillvägagångssätt för att isolera antigenspecifika T-celler är baserad på CCS-med användning av en bi-specifikt reagens för att känna igen CD45 och IFN-γ. Såsom visas, kan denna metod användas för att generera klinisk kvalitet CMV-specifika T-celler med användning av en automatiserad cellanriknings CCS anordning (Figur 1B).
CMV-specifika T-celler genereras genom inkubering överlappande peptider från CMV-pp65-antigen med leukaferes totala nukleära celler (TNC) från CMV-seropositiva donatorer. Dessa peptider, som visas i samband med HLA-antigen (HLA), aktivera CMV pp65 specifika T-celler inom TNC att utsöndra IFN-γ. Dessa T-celler kan sedan "fångas" och magnetiskt separerade. Driften av den första generationens cellanrikningsanordning (figur 1 A) som krävs personal skickliga i cellodling under GMP förhållanden, och samordning av personal för att genomföra de många sTeps nödvändigt att ta fram en "fångad" produkt.
Det förfarande som krävs typiskt 10 till 12 timmar av kontinuerlig drift, och därför personal sannolikt att behöva arbeta mer än två skift i GMP anläggningen. Dessa begränsningar är nu undvikas genom införandet av ett andra generationens ordningen (visas i figur 1B). Denna anordning åtar magnetisk anrikning, liknande den första generationen enhet, men automatiserar andra aspekter av CCS i en unbreached tillvägagångssätt. Detta minskar avsevärt belastningen på GMP laget som de flesta av stegen kan åstadkommas utan uppsikt av personal. Eftersom vidare anordningen fungerar som ett slutet system, de antigenspecifika T-celler kan fångas upp och bearbetas på bänkskiva utom de steg som ingår i leukaferes isolering och beredning av material innan instrumentet. Detaljer av den fullständiga instrumentering och funktionaliteten i denna andra generationens cell anrikning enhet har pubinrättats 11.
Här beskriver vi åtgärder för att berika CMV pp65 specifika T-celler från en steady-state aferes produkten med hjälp av automatiserad cellanriknings CCS-system. När isolerade, kan dessa CMV-specifika T-celler omedelbart infunderas i en patient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptiv T-cellterapi har visat sig vara ett hållbart alternativ för att behandla B-cellmaligniteter 4. Dess terapeutiska potentialen är beroende av infusion önskat antal mål antigenspecifika T-celler som saknar replika åldrande 2. Detta kan uppnås genom att sortera ut en ren population av antigenspecifika T-celler från expanderade T-celler i enlighet med gällande god tillverkningssed. Två sorteringsförfaranden används ofta, nämligen fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magneti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
