Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

In dit werk beschrijven we een nieuwe aanpak die ex vivo drug gevoeligheid assays en digitale beeldanalyse combineert chemogevoeligheid en heterogeniteit van de patiënt afgeleid multiple myeloma (MM) cellen te schatten. Deze bestaat eruit zaaien primaire MM cellen vers gewonnen uit beenmergaspiraten in microfluïdische kamers uitgevoerd in multi-well platen, elk bestaande uit een reconstructie van beenmerg micro-omgeving, waaronder extracellulaire matrix (collageen of basaal membraan matrix) en stroma (patiëntspecifieke afgeleide mesenchymale stamcellen) of afgeleide humane endotheelcellen (HUVEC). De kamers worden verdoofd met verschillende middelen en concentraties en worden afgebeeld achtereenvolgens gedurende 96 uur via helderveld microscopie in een gemotoriseerde microscoop uitgerust met een digitale camera. Digitale beeldanalyse software herkent levende en dode cellen van de aanwezigheid of afwezigheid van membraan beweging en worden curven verandering in levensvatbaarheid als functie of geneesmiddel concentratie en de belichtingstijd. We gebruiken een rekenmodel voor de parameters van chemosensitiviteit van de tumor bevolking elk geneesmiddel, alsmede het aantal aanwezige als maat voor tumor heterogeniteit subpopulaties te bepalen. Deze geïndividualiseerde modellen kunnen vervolgens worden gesimuleerd therapeutische regimes en schatten klinische respons.

Introduction

Het doel van deze methode is de geneesmiddelgevoeligheid van multiple myeloma (MM) te karakteriseren primaire cellen om een panel van middelen ex vivo, zo dicht mogelijk bij fysiologische omstandigheden en voldoende nauwkeurig dat deze resultaten kunnen worden gebruikt voor het identificeren chemoresistente sub- bevolkingen in de tumor lasten en, uiteindelijk, te parametriseren rekenmodellen ontwikkeld om de klinische respons te schatten.

Rekenmodellen zijn krachtige instrumenten om complexe systemen, zoals kanker-gastheer-therapie interacties analyseren. Maar modellen zijn slechts zo goed als de gegevens die worden gebruikt om ze te parametriseren. Helaas kunnen de meeste gegevens in de literatuur niet worden gebruikt in de huidige vorm dergelijke modellen parametriseren, omdat ze vaak verkregen in elkaar uitsluitende experimentele omstandigheden. Zo worden nieuwe experimenten vaak nodig met het doel het verkrijgen van het stel experimentele parameters vereist. Het meest levensvatbaarheid assays zijn echter destructief en thons beperkt tot een klein aantal tijdstippen, vaak slechts één. Dit sterk benadeelt het gebruik van chemosensitiviteit assays te parametriseren rekenmodellen, aangezien dergelijke experimenten niet om informatie over de temporele dynamiek van het systeem. Dit geldt vooral bij primaire kankercellen, die vaak beperkt tot een paar miljoen per monster, en hebben een korte levensduur na biopsie, waardoor het aantal beschikbare experimentele omstandigheden beperken. Daarnaast hebben de meeste levensvatbaarheid-assays vereisen de scheiding van de kanker van de niet-kanker (stroma) cellen bij de kwantificering, die extra werk toevoegt aan het protocol verder verstoort de cellen en beperkt het aantal experimenten die kunnen worden uitgevoerd .

40 jaar geleden, zalm en collaborateurs ¹ voorgesteld hun beroemde in vitro kolonievorming assay voor de beoordeling van chemosensitiviteit van tumorcellen. Helaas is deze test gevonden wisselend succes vanwege het kleine aantal meervoudige myeloma (MM) patiëntenmonsters die kunnen vormen kolonies onder controle condities waren: Er werd geschat dat slechts een kleine subgroep van 0,001% tot 0,1% van MM cellen die in staat zijn tot replicatie, waarbij genoemd als multiple myeloma stamcellen ^2. Dit beperkt aanzienlijk de slaagkans van de assay en het aantal geneesmiddelen die kunnen worden getest op een bepaald moment, zelfs in recente modellen ^3. Deze kwestie is nu veel belangrijker als MM middelen (standaard of experimenteel) zijn talrijker dan vier decennia geleden.

Een belangrijke beperking van deze vroege testen is hun dichotome output: ofwel een patiënt is "gevoelig" of "bestand" om een ​​bepaalde drug. Geen informatie wordt verschaft met betrekking tot de gevoeligheid en heterogeniteit van de tumor bevolking. Zo zou patiënten met kleine subpopulaties van snelgroeiende resistente cellen worden ingedeeld als "gevoelig" voor therapie, maar zou binnenkort recidief, en dus niet benEFIT van de behandeling. Gezien het belang van de duur van de respons in overall overleving (OS) van kankerpatiënten ^4,5, is het duidelijk hoe deze assays niet goed kunnen inschatten OS constant.

Om deze beperkingen te omzeilen, en kunnen patiëntspecifieke computermodellen die aangepast klinische respons op een panel van drugs zou schatten genereren, hebben wij een werkwijze voor niet-destructief testen drug gevoeligheid van multiple myeloma (MM) cellijnen ontwikkeld en primaire MM cellen in een ex vivo reconstructie van het beenmerg micro-omgeving, met inbegrip van extracellulaire matrix en stroma ^6. Deze test had echter de beperking van te vertrouwen op een bepaalde commerciële microfluidic slide, waarvan de afmetingen en de kosten beperkt aantal experimenten of geneesmiddelen die tegelijkertijd in een gegeven apparaat kunnen worden uitgevoerd.

Het hier beschreven systeem breidt deze originele test in een hoog-throughput organotypische dosis-response platform, in vitro screenen van geneesmiddelen op basis van een digitale beeldanalyse-algoritme voor niet-destructieve kwantificeren cellevensvatbaarheid. Elk goed in 384 of 1536 putjes is een 3D-reconstructie van het beenmerg micro-omgeving, met inbegrip van primaire MM cellen, extracellulaire matrix en patiënt afgeleide stroma en groeifactoren. Live microscopie en digitale beeldanalyse gebruikt om celdood gebeurtenissen in verschillende geneesmiddelconcentraties, die worden gebruikt om dosis-respons oppervlakken genereren detecteren. Uit de in vitro data, een mathematisch model identificeert de grootte en de chemosensitiviteit van subpopulaties binnen tumorlast van de patiënt, en kan worden gebruikt om te simuleren hoe de tumor zal reageren op het geneesmiddel (en) in fysiologische omstandigheden in een klinisch regime ⁶ ( Figuur 1).

De belangrijkste vernieuwingen van dit platform zijn: (a) kleine aantal kankercellen vereist (1.000-10.000 per drug concentrantsoen); (B) evaluatie van de werkzaamheid van het geneesmiddel in fysiologische omstandigheden (extracellulaire matrix, stroma, patiënt afgeleide groeifactoren); (C) Geen toxiciteit van levensvatbaarheid markers ⁷ omdat alleen helderveld imaging wordt gebruikt, dus geen noodzaak om cellen met fluorescentie ⁸ of bioluminescentie ⁹ transfecteren; (D) continue beeldvorming verschaft geneesmiddelwerking als functie van de concentratie en de blootstellingstijd (farmacodynamica); en (e) de integratie van in vitro en computationele evolutiemodellen te schatten klinische resultaat ⁶ (Silva et al., in voorbereiding).

De belangrijkste factor waardoor de digitale beeldanalyse algoritme om kanker te onderscheiden van stromale cellen hun verschillende affiniteit aan de bodem van de put: MM cellen niet hechten, en in suspensie blijven in de matrix, terwijl stromale cellen hechten aan de bodem van de goed en dan strekken.

Deze scheiding gebeurt zelfs al MM en stroma eenopnieuw geënt op hetzelfde moment, en treedt in de O / N proces van incubatie. Het stoppen met draaien in de centrifuge na zaaien van de plaat verder versnelt dit proces. Bijgevolg MM cellen blijken in het beeld als round heldere disks omgeven door een donkere ring, terwijl de stroma handhaaft een laag profiel en een donkere kleur (Figuur 2). Aldus was de zuiverheid in zijn huidige vorm is het meest geschikt voor niet-hechtende kankercellen, hoewel correcties in het algoritme kunnen worden gedaan afzonderlijke kanker en stroma op basis van andere morfologische kenmerken, zoals grootte en vorm. In dit protocol beschrijven we twee soorten extracellulaire matrix (collageen en basaalmembraan matrix) en twee typen co-culturen met (beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen) BMSC en HUVEC, die de interstitiële en perivasculaire nissen van het beenmerg respectievelijk.

Met behulp van een 384-wells plaat, 5 concentraties per drug en twee herhalingen, waren we in staat om te test tot 31 verschillende geneesmiddelen met het monster van een patiënt. In 1536 putjes dit aantal 127. Figuur 3 toont de layout momenteel gebruikt voor handmatige zaaien van cellen, terwijl Supplemental Figuur 1 geeft de optimale verdeling met een robot pipet. In het ontwerp van figuur 3, kan elke 384-wells plaat dragen 3 monsters van patiënten met 7 verschillende drugs, of één patiënt monster getest met 21 drugs. Elk geneesmiddel wordt voorgesteld door 5 concentraties, en elke conditie geënt in duplo. 4 controleputjes (geen geneesmiddel toegevoegd) worden gezaaid voor elke set van 7 geneesmiddelen (bv putten 36-39, 126-129 en 200-203). Om de potentie van de gebruikte geneesmiddelen te waarborgen, een humane myeloma cellijn (bijvoorbeeld H929 of MM1.S) is gezaaid en verdoofd in duplo bij de hoogste concentratie van elk van de middelen die gebruikt worden (wells 76-89). De positieve cellijn zorgt ervoor dat de medicijnen die gebruikt worden over voldoende potentie, omdat hun dosis-respons curves zijn vergelijkbaar across experimenten. Twee putjes worden geënt met een myeloma cellijn als controle voor de omgevingsomstandigheden, met andere woorden, om mogelijke problemen op het werkblad incubator (wells 75 en 90) ontdekt gedurende beeldvorming. De opsomming van de putjes volgens een zigzagpatroon om de afstand die het gemotoriseerde fase van de microscoop, die acquisitietijd wordt verminderd en de slijtage van de apparatuur.

Protocol

Het gebruik van menselijke cellen afkomstig van biopten zoals hieronder beschreven werd goedgekeurd door Moffitt de Institutional Review Board en uitgevoerd onder de klinische proef MCC # 14745 uitgevoerd op het H. Lee Moffitt Cancer Center en Research Institute. 1. Het sorteren van MM Cellen van beenmergaspiraten Verzamel beenmergaspiraten (20 ml) van patiënten in natriumheparine spuit. Isoleer mononucleaire cellen door centrifugeren verdund beenmerg (1: 1 met steriel …

Representative Results

De stroom van het experiment wordt kort beschreven in figuur 1 of alle stappen met succes zijn voltooid, worden de beelden verkregen door de microscoop moet gelijk zijn Figuur 2:. Leef MM cellen worden duidelijk gezien als lichte schijven en BMSCs of HUVEC moeten nauwelijks zichtbaar en goed verdeeld in de achtergrond. Zoals blijkt uit figuur 2A, MM cellen zijn tussen de ene patiënt naar de andere, maar over het algemeen zijn ze kleiner dan cellijnen. Omdat ze praktisc…

Discussion

Kortom, dit is een krachtige en high throughput methode chemogevoeligheid van primaire MM cellen en ex vivo farmacodynamiek van drugs kwantificeren in een reconstructie van het beenmerg. De kritische stappen in dit protocol de juiste zaaien van de putten en adequate gericht (zie Figuur 2 voor verwachte resultaten) waarborgen dat MM en stromale cellen gelijkmatig verdeeld, dat stromale cellen hechtend aan de bodem van de put, dat alle MM cellen in hetzelfde beeldvlak, en MM cellen het aspect van…

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system