Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

Neste trabalho, descrevemos uma nova abordagem que combina ensaios ex vivo de sensibilidade a drogas e análise de imagem digital para estimar chemosensitivity e heterogeneidade de mieloma múltiplo células derivadas de pacientes (MM). Esta abordagem consiste na sementeira de células primárias MM recentemente extraídos a partir de aspirados de medula óssea para as câmaras de microfluidos aplicadas em placas de poços múltiplos, cada um consistindo de uma reconstrução do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular (colagénio ou matriz de membrana basal) e estroma (paciente- as células estaminais mesenquimais derivadas) ou células endoteliais de origem humana (HUVECs). As câmaras são drogados com diferentes agentes e concentrações, e são gravadas sequencialmente durante 96 horas por meio de microscopia de campo claro, em um microscópio motorizado equipado com uma câmera digital. Software de análise de imagem digital detecta as células vivas e mortas da presença ou ausência de movimento da membrana, e gera curvas de alteração da viabilidade como uma função óf concentração de fármaco e o tempo de exposição. Usamos um modelo computacional para determinar os parâmetros de quimio-sensibilidade da população do tumor para cada droga, bem como o número de sub-populações apresentam-se como uma medida da heterogeneidade de tumores. Estes modelos adaptados para o paciente pode, então, ser usado para simular regimes terapêuticos e estimar a resposta clínica.

Introduction

O objectivo deste método é para caracterizar a sensibilidade à droga de mieloma múltiplo (MM), as células primárias a um painel de agentes ex vivo, tão próximo quanto possível das condições fisiológicas, e com suficiente precisão que estes resultados podem ser usados ​​para identificar, resistente à quimioterapia sub populações dentro a carga tumoral e, em última instância, para parametrizar modelos computacionais desenvolvidos para estimar a resposta clínica.

Modelos computacionais são ferramentas poderosas para analisar sistemas complexos, tais como interações cancer-host-terapia. No entanto, os modelos são apenas tão bom quanto os dados utilizados para parametrizar-los. Infelizmente, a maioria dos dados disponíveis na literatura não podem ser utilizados na sua forma actual para parametrizar tais modelos, uma vez que muitas vezes são obtidos em condições experimentais que se excluem mutuamente. Assim, novas experiências são muitas vezes necessários com o objetivo de obter o conjunto de parâmetros experimentais necessários. A maioria dos ensaios de viabilidade, no entanto, são destrutivos e thnos limitada a um pequeno número de pontos de tempo, muitas vezes, apenas um. Isso prejudica enormemente o uso de ensaios quimiossensibilidade para parametrizar modelos computacionais, uma vez que tais experiências não fornecem informações sobre a dinâmica temporal do sistema. Isto é especialmente verdadeiro com as células cancerosas primárias, que são muitas vezes limitadas a alguns milhões por amostra, e têm uma vida útil curta após a biópsia, limitando assim o número de condições experimentais disponíveis. Além disso, a maioria dos ensaios de viabilidade exigir a separação do cancro das não-cancro (estroma), as células no momento da quantificação, o que aumenta o trabalho extra para o protocolo, perturba ainda mais as células, e limita o número de experiências que pode ser realizado .

Há 40 anos, Salmon e colaboradores ^uma proposta de seu famoso ensaio de formação de colónias vitro para avaliação de chemosensitivity de células tumorais. Infelizmente este ensaio encontrou o sucesso misto, devido ao pequeno número de mye múltiplaloma (MM) amostras de doentes que foram capazes de formar colónias em condições de controlo: Estimou-se que apenas um pequeno subgrupo de 0,001% a 0,1% de culas de MM foram capazes de replicação, sendo denominado como células estaminais mieloma múltiplo ^2. Isto limita significativamente a taxa de sucesso do ensaio e do número de fármacos que pode ser testado de uma só vez, até mesmo nos modelos mais recentes ^3. Esta questão é muito mais importante agora, quando agentes MM (padrão ou experimentais) são mais numerosos do que há quatro décadas.

Uma das principais limitações destes primeiros ensaios é a sua saída dicotomizada: ou um paciente é "sensível" ou "resistentes" a um fármaco particular. Não são fornecidas informações sobre o grau de sensibilidade e heterogeneidade da população do tumor. Assim, os pacientes com pequenos sub-populações de células de crescimento rápido resistentes seriam classificados como "sensíveis" à terapia, mas recaída em breve, e, portanto, não benAFE do tratamento. Dada a importância da duração da resposta na sobrevida global (OS) de pacientes com câncer ^{de 4,5,} é claro como estes ensaios não foram capazes de estimar corretamente OS de forma consistente.

A fim de contornar estas limitações, e para ser capaz de gerar modelos computacionais específicas do paciente que se estimar a resposta clínica personalizado para um painel de drogas, nós desenvolvemos um método para teste de sensibilidade ao fármaco de forma não destrutiva de mieloma múltiplo (MM) linhas celulares e culas do MM primários em uma reconstrução ex vivo do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular e estroma ^6. Este ensaio, no entanto, tinha a limitação de depender de um slide microfluídico comercial particular, cujas dimensões e custo restringiu o número de experimentos ou drogas que poderiam ser realizados de uma só vez em uma determinada peça de equipamento.

O sistema aqui descrito estende este ensaio original em um alto-throughput plataforma de dose-resposta organotípica, in vitro para rastreio de drogas, com base num algoritmo de análise de imagem digital para quantificar de forma não destrutiva a viabilidade celular. Cada poço em 384 ou 1536 poços placas é uma reconstrução em 3D do microambiente da medula óssea, incluindo células primárias mM, matriz extracelular, e do estroma e factores de crescimento derivados do paciente. Microscopia vivo e análise de imagem digital são utilizados para detectar acontecimentos de morte celular em diferentes concentrações de fármaco, os quais são utilizados para gerar as superfícies de dose-resposta. A partir dos dados in vitro, um modelo matemático identifica o tamanho e a quimiossensibilidade de sub-populações dentro a carga tumoral do paciente, e pode ser utilizado para simular a forma como o tumor responderá à droga (s) em condições fisiológicas, num regime clínico ⁶ ( Figura 1).

As principais inovações desta plataforma são: (a) pequeno número de células cancerosas necessários (1.000-10.000 por concent drogaração); (B) avaliação da eficácia do fármaco em condições fisiológicas (matriz extracelular, estroma, fatores de crescimento derivado do paciente); (C) Nenhuma toxicidade de viabilidade marcadores já que apenas ⁷ de imagens de campo claro é usado, portanto, não há necessidade de transferir células com fluorescência ⁸ ou ⁹ bioluminescência; (D) proporciona um efeito de imagem contínua de droga como uma função da concentração e do tempo de exposição (farmacodinâmica); e (e) entre a integração in vitro e modelos computacionais evolutivos, para estimar o resultado clínico ⁶ (Silva et al., em preparação).

O factor essencial que permite que o algoritmo de análise de imagem digital para discernir cancro a partir de células do estroma é a sua diferente afinidade para o fundo do poço: culas do MM não aderem, e permanecem em suspensão na matriz, enquanto que as células estromais aderir ao fundo do bem e em seguida, alongamento.

Esta separação ocorre mesmo que MM e estroma umre inoculadas ao mesmo tempo, e ocorre durante o processo de S / N de incubação. O girar para baixo no centrifugador seguinte semeadura da placa acelera ainda mais o processo. Como consequência, as células MM aparecem na imagem como discos brilhantes redonda rodeada por um anel de escuro, enquanto que o estroma mantém um perfil baixo e um tom mais escuro (Figura 2). Assim, o ensaio na sua forma actual é o mais adequado para as células de cancro não-aderentes, embora ajustes no algoritmo poderia ser feito para o cancro e estroma separados com base em outras características morfológicas, tais como o tamanho e forma. Neste protocolo, descrevem dois tipos de matriz extracelular (colagénio e da matriz da membrana basal), bem como dois tipos de co-culturas, com (derivadas de medula óssea as células estaminais mesenquimais) BMSC e HUVEC, representando os nichos intersticial e perivascular da medula óssea , respectivamente.

Usando uma placa de 384 poços, 5 concentrações por droga e duas repetições, fomos capazes de test até 31 drogas diferentes com a amostra de um único paciente. Em placas de 1536 poços este número é 127. A Figura 3 ilustra a disposição actualmente usada para a propagação de células Manual, enquanto que a Figura 1 representa uma carta a distribuição óptima utilizando um pipetador robotizado. No desenho da Figura 3, cada placa de 384 poços pode transportar três amostras de doentes com sete drogas diferentes, ou uma amostra de pacientes testados com 21 drogas. Cada droga é representado por 5 concentrações, e cada condição é semeada em duplicado. 4 poços de controlo (sem fármaco adicionado) são semeadas para cada conjunto de sete medicamentos (por exemplo, poços 36-39, 126-129 e 200-203). Para garantir a eficácia dos fármacos utilizados, uma linha de células de mieloma humano (por exemplo, H929 ou MM1.S) também é semeado, e drogados em duplicado na concentração mais elevada de cada um dos fármacos utilizados poços (76-89). O controlo positivo linha celular assegura que as drogas utilizadas têm uma potência adequada, uma vez que as suas curvas de resposta de dose são ac comparávelexperimentos de Ross. Dois poços foram semeadas com uma linha de células de mieloma como controlo para as condições ambientais, em outras palavras, para detectar possíveis problemas na incubadora de bancada durante imagiologia poços (75 e 90). A enumeração dos poços segue um padrão em zigue-zague, a fim de reduzir a distância percorrida pela fase motorizada do microscópio, o que reduz o tempo de aquisição e reduz o desgaste do equipamento.

Protocol

O uso de células humanas derivadas de biópsias conforme descrito abaixo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Moffitt e conduzidos sob o ensaio clínico MCC # 14745 realizado no H. Lee Moffitt Cancer Center e Instituto de Pesquisa. 1. Seleção de MM Células de Medula Óssea aspirados Recolhe aspirados de medula óssea (20 ml) a partir de pacientes em heparina sódica seringa. Isolar células mononucleares por centrifugação medula diluído (1: 1 com PBS es…

Representative Results

O fluxo da experiência é brevemente descrito na Figura 1 Se todas as etapas são completadas com sucesso, as imagens obtidas por microscópio deve ser equivalente à Figura 2:. Vivo culas do MM deve ser claramente visto como discos brilhantes e BMSC ou HUVECs deve ser pouco visível e bem distribuídas no fundo. Como pode ser visto na Figura 2A, culas do MM variam em tamanho de um paciente para outro, mas, em geral, eles são menores do que as linhas celulares. Uma ve…

Discussion

Em resumo, este é um método poderoso e alta taxa de transferência para quantificar a quimiossensibilidade de culas do MM primárias e ex vivo farmacodinâmica da droga através de uma reconstrução da medula óssea. Os passos críticos dentro deste protocolo são a semeadura adequada dos poços e concentrando adequada (ver Figura 2 para os resultados esperados): assegurar que as células estromais MM e são distribuídos uniformemente, que as células estromais são aderentes ao fundo do po…

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system