Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
В этой работе мы описываем новый подход, который сочетает в себе Экс Vivo анализов чувствительности препарат и цифровой анализ изображения для оценки химиочувствительность и неоднородность множественной миеломы (ММ) клеток пациента, полученных. Этот подход состоит в посеве первичных клеток ММ недавно извлеченные из аспирации костного мозга в микрофлюидных камер, реализованных в нескольких луночных планшетах, каждый из которых состоит из реконструкции микросреды костного мозга, в том числе внеклеточного матрикса (коллаген или базальную мембрану матрицы) и стромы (на пациента мезенхимальных стволовых клеток) или эндотелиальные клетки человека, полученные (HUVECs). Камеры накачивают различных агентов и концентрациях и загружаются последовательно в течение 96 ч с помощью светлой микроскопии, в моторизованной микроскопа, снабженного цифровой камерой. Цифровой программного обеспечения для анализа изображений обнаруживает живых и мертвых клеток из наличия или отсутствия движения мембраны, и генерирует кривые изменений в жизнеспособности как функции ое концентрация препарата и время экспозиции. Мы используем вычислительную модель для определения параметров химиочувствительность населения опухоли на каждого препарата, а также количество групп населения, присутствующих в качестве меры опухоли неоднородности. Эти модели пациентом с учетом затем могут быть использованы для моделирования терапевтические режимы и оценить клинический ответ.
Introduction
Цель этого метода заключается в характеристике чувствительности к лекарству множественной миеломы (ММ) первичные ячейки в панели агентов экс естественных условиях, как можно ближе к физиологическим условиям, и с достаточной точностью, что эти результаты могут быть использованы для идентификации химиорезистентных югу популяции в пределах опухолевой и, в конечном счете, параметризации вычислительные модели, предназначенные для оценки клинической реакции.
Вычислительные модели являются мощными инструментами для анализа сложных систем, таких как рак хост-терапии взаимодействий. Тем не менее, модели только так хорошо, как данные, используемые для параметрирования. К сожалению, большинство данных, доступных в литературе не может быть использован в его текущей форме для параметризации таких моделей, так как они часто получают в взаимоисключающих экспериментальных условиях. Таким образом, новые эксперименты часто требуются с целью получения набора экспериментальных параметров, необходимых. Большинство жизнеспособность анализы, однако, являются разрушительными и йнам ограничено небольшим количеством временных точках, как правило, только один. Это значительно затрудняет использование химиочувствительность анализов для параметризации вычислительной модели, поскольку такие эксперименты не предоставляют информацию о временной динамики системы. Это особенно верно с первичными раковых клеток, которые часто ограничены до нескольких миллионов в образце, и имеют короткую продолжительность жизни после биопсии, тем самым ограничивая число доступных экспериментальных условиях. Кроме того, большинство жизнеспособности анализы требуют отделение от рака неонкологической (стромы) клеток на момент количественного, который добавляет дополнительную работу с протоколом, дополнительно возмущает клетки, и ограничивает количество экспериментов, которые могут быть выполнены ,
40 лет назад, лосось и сотрудники 1 предложила их знаменитый в пробирке анализа формирования колонии для оценки химиочувствительность опухолевых клеток. К сожалению, этот анализ обнаружил переменным успехом из-за малого числа множественных MYEлома (мм) образцов пациентов, которые были способны образовывать колонии в контрольных условиях: Было подсчитано, что только небольшая подгруппа 0,001% до 0,1% клеток ММ были способны к репликации, которые называют как множественная миелома стволовых клеток 2. Это значительно ограничивает вероятность успеха анализа и ряд препаратов, которые могут быть проверены в одно время, даже в более поздних моделях 3. Этот вопрос гораздо более важно сейчас, когда MM агенты (стандартные или экспериментальные), являются более многочисленными, чем четыре десятилетия назад.
Основным недостатком этих ранних анализов является их дихотомии выход: либо пациент "чувствительный" или "устойчивых" для конкретного препарата. Никакая информация не предоставляется в отношении степени чувствительности и неоднородность населения опухоли. Таким образом, пациенты с небольшими субпопуляций быстрорастущих клеток, резистентных к будут классифицироваться как «чувствительны» к терапии, но будет рецидив в ближайшее время, и, таким образом, не бенefit от лечения. Учитывая важность продолжительности ответа в общей выживаемости (OS) больных раком 4,5, это ясно, как эти анализы не смогли должным образом оценить ОС последовательно.
Для того, чтобы обойти эти ограничения, и быть в состоянии генерировать конкретного пациента вычислительные модели, которые бы оценить персональную клинический ответ на панели наркотиков, мы разработали метод для чувствительности неразрушающим тестирование наркотиков множественной миеломы (ММ) клеточных линий и первичные клетки мм экс естественных условиях реконструкции микросреды костного мозга, в том числе внеклеточного матрикса и стромы 6. Этот анализ, однако, было ограничение, опираясь на конкретном коммерческом микрофлюидного горкой, чьи размеры и стоимость ограничили количество экспериментов или лекарств, которые могут быть выполнены сразу в данной части оборудования.
Здесь описано система расширяет этот оригинальный анализ в высокой-throughput органотипической платформу доза-ответ, для скрининга в пробирке наркотиков, основанный на алгоритме анализа цифровых изображений в неразрушающим количественно жизнеспособность клеток. Каждый хорошо в 384 или 1536-луночных планшетах является 3D-реконструкция микроокружения костного мозга, в том числе первичных клеток ММ, внеклеточного матрикса и пациентом происходит стромы и факторов роста. Живой микроскопии и анализа цифровых изображений используются для обнаружения события клеточной гибели в разных концентраций препарата, которые используются для создания поверхностей доза-ответ. Из данных в пробирке, математическая модель определяет размер и химиочувствительность субпопуляций в пределах опухолевой пациента, и может быть использован для моделирования, как опухоль будет реагировать на препарат (ы) в физиологических условиях в клиническом режиме 6 ( Фигура 1).
Основные новшества этой платформы являются: (а) небольшое количество раковых клеток, необходимых (1000-10000 за наркотиками ОБОГАЩЕНИЯпаек); (Б) оценка эффективности препарата в физиологических условиях (внеклеточного матрикса, стромы, пациентов факторы роста); (С) Нет токсичность жизнеспособности маркеров 7, поскольку только яркой визуализации поля не используется, таким образом, нет необходимости для трансфекции клеток с флуоресценции 8 или 9 биолюминесценции; (D) непрерывного изображения обеспечивает эффект наркотиков в зависимости от концентрации и времени воздействия (фармакодинамики); и (е) интеграция между в пробирке и вычислительных эволюционных моделей, чтобы оценить клинические результаты (6 Silva и др., в процессе подготовки).
Ключевым фактором, который позволяет алгоритм анализа цифровых изображений, чтобы различить рак из стромальных клеток является их отличается сродством к нижней части скважины: клетки ММ не прилипают, и остаются во взвешенном состоянии в матрице, в то время как стромальные клетки прилипают к нижней части Ну а потом растянуть.
Это разделение происходит, несмотря мм и стромы аповторно засевали в то же время, и происходит во время O / N процессе инкубации. Спиннинг вниз в центрифуге следующие посев пластины дополнительно ускоряет этот процесс. Как следствие, клетки ММ предстанет в образе как круглых ярких дисков, окруженных темным кольцом, в то время как стромы поддерживает низкий профиль и более темный оттенок (рис 2). Таким образом, анализ в его нынешнем виде лучше всего подходит для неадгезивных раковых клеток, хотя коррективы в алгоритм может быть сделано для отдельного рака и стромы на основе других морфологических особенностей, таких как размер и форма. В этом протоколе мы опишем два типа внеклеточного матрикса (коллаген и базальной мембраны матрицы), а также два типа сокультурах, с (костный мозг мезенхимальных стволовых клеток) BMSC и HUVECs, представляющий интерстициальные и периваскулярные ниши костного мозга соответственно.
Использование 384-луночного планшета с 5 концентрации препарата в два повтора и мы смогли ТЭСт до 31 различных препаратов с образцом одного пациента. В 1536-луночных планшетах это число 127. На рисунке 3 изображен макет в настоящее время используется для ручного посева клеток, в то время как Справочная Рисунок 1 представляет собой оптимальное распределение помощью робота пипетки. При проектировании на рисунке 3, каждый 384-а пластина может перевозить 3 пробы пациентов с 7 различных препаратов, или один образец пациента протестированы с 21 препаратов. Каждый препарат представлен 5 концентраций, и каждое условие высевают в дубликатах. 4 контрольные лунки (лекарственное средство не добавлено) высевают для каждого набора 7 препаратов (например, скважины 36-39, 126-129 и 200-203). Для обеспечения потенции лекарств, используемых, линии клеток миеломы человека (например, H929 или MM1.S) также семенами, и наркотики в двух экземплярах на самом высоком концентрации каждого из препаратов, используемых (скважины) 76-89. Положительный контроль клеточной линии гарантирует, что препараты, используемые иметь достаточное потенцию, так как их АЧХ дозы сравнимы переменного токаРосс эксперименты. Две скважины высевают с миеломной клеточной линии в качестве контроля для условий окружающей среды, иными словами, чтобы обнаружить возможные проблемы в настольной инкубаторе во время съемки (75 скважин и 90). Перечень скважин следует зигзагообразный узор, чтобы уменьшить расстояние, пройденное автоматическими столик микроскопа, который сокращает время приобретения и уменьшает износ оборудования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В целом, это мощный и высокий метод пропускная количественно химиочувствительность первичных клеток ММ и бывших естественных условиях фармакодинамики лекарственных средств в реконструкцию костного мозга. Критические шаги в рамках этого протокола собственно посев из скважин и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано государством Флориды Бэнкхэд-Коли Team науки Грант (2BT03), Национальных Институтов Здоровья / Национального института рака (1R21CA164322-01) и Moffitt рака Центра Team науки Гранта. Эта работа была частично поддержана в трансляционных исследований основной комплекс в H. Lee Моффит онкологический центр и научно-исследовательский институт, в NCI назначенного всеобъемлющем онкологического центра (P30-CA076292). Доступ к первичных клеток стало возможным через Total Care протокола Рак в Центре рака Moffitt.
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
References
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
