En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

I detta arbete beskriver vi en ny metod som kombinerar ex vivo drogkänslighetsanalyser och digital bildanalys för att uppskatta chemosensitivity och heterogenitet av patienthärledda multipelt myelom (MM) celler. Denna strategi består i sådd primära MM celler nyligen utvinns ur benmärgsaspirat i mikroflödessystem kammare genomförs i flerbrunnsplattor, var och en består av en rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive extracellulära matrix (kollagen eller basalmembranet matris) och stroma (patient- mesenchymala stamceller) eller humant ursprung endotelceller (HUVEC). Kamrarna är drogade med olika medel och koncentrationer, och avbildas sekventiellt för 96 h genom ljusfältsmikroskopi, i en motoriserad mikroskop utrustat med en digitalkamera. Digital bildanalys Programvaran upptäcker levande och döda celler från närvaron eller frånvaron av membranrörelse, och genererar kurvorna av förändring i lönsamhet som en funktion of läkemedelskoncentration och exponeringstid. Vi använder en beräkningsmodell för att bestämma parametrarna för chemosensitivity av tumören befolkningen att varje läkemedel, såväl som antalet sub-populationer som finns som ett mått på tumör heterogenitet. Dessa patientanpassade modeller kan sedan användas för att simulera terapeutiska regimer och uppskatta kliniska svaret.

Introduction

Målet med denna metod är att karakterisera läkemedelskänslighet av multipelt myelom (MM) primära celler till en panel av medel ex vivo, så nära som möjligt till fysiologiska betingelser, och med tillräcklig precision att dessa resultat kan användas för att identifiera kemoterapiresistent sub- populationerna inom tumörbördan och, slutligen, för parameter beräkningsmodeller utformade för att uppskatta det kliniska svaret.

Beräkningsmodeller är kraftfulla verktyg för att analysera komplexa system, såsom cancer-värd-terapi interaktioner. Men modeller är bara så bra som de data som används för parameter dem. Tyvärr kan de flesta tillgängliga uppgifter i litteraturen inte användas i sin nuvarande form för parameter sådana modeller, eftersom de ofta erhålls i ömsesidigt uteslutande experimentella förhållanden. Sålunda är nya experiment krävs ofta med målet att erhålla uppsättningen av experimentella parametrar som behövs. De flesta viabilitetsanalyser, dock är destruktiva och thoss begränsade till ett litet antal tidpunkter, ofta bara ett. Detta handikapp kraftigt användningen av chemosensitivity analyser för parameter beräkningsmodeller, eftersom sådana försök misslyckas med att ge information om den tidsmässiga dynamiken i systemet. Detta gäller särskilt med primära cancerceller, som ofta är begränsade till ett fåtal miljoner per prov, och har en kort livslängd efter biopsi, vilket begränsar antalet experimentella förhållanden som. Dessutom har de flesta viabilitetsanalyser kräver separation av cancer från de icke-cancer (stroma) celler vid tidpunkten för kvantifiering, vilket ger extra arbete till protokollet, vilket ytterligare stör cellerna, och begränsar antalet experiment som kan utföras .

40 år sedan, lax och medarbetare ¹ föreslog deras berömda i kolonibildning in vitro analys för bedömning av chemosensitivity av tumörceller. Tyvärr denna analys fann blandad framgång på grund av det lilla antalet multipla myeloma (MM) patientprover som var i stånd att bilda kolonier under kontroll förhållanden: Man uppskattar att endast en liten subgrupp av 0,001% till 0,1% av MM-celler kan föröka sig, som betecknas som multipelt myelom stamceller ^2. Detta begränsade signifikant framgång för analysen och det antal läkemedel som kan testas på en gång, även på senare modeller ^3. Denna fråga är mycket viktigare nu när MM medel (standard eller experimentella) är fler än fyra decennier sedan.

En viktig begränsning av dessa tidiga analyser är deras dikotomiserades utgång: antingen en patient är "känslig" eller "resistent" till ett visst läkemedel. Ingen information ges om graden av känslighet och heterogenitet av tumören befolkningen. Således skulle patienter med små delpopulationer av snabbväxande resistenta celler klassificeras som "känsliga" till behandling, men skulle återfall inom kort, och därmed inte benbestämda från behandling. Med tanke på betydelsen av varaktigheten av svaret i total överlevnad (OS) av cancerpatienter ^4,5, är det klart hur dessa analyser kunde inte riktigt uppskatta OS konsekvent.

För att kringgå dessa begränsningar och för att kunna generera patientspecifika beräkningsmodeller som skulle uppskatta personlig kliniskt svar på en panel av droger, har vi utvecklat en metod för icke-förstörande testning läkemedelskänslighet av multipelt myelom (MM) cellinjer och primära MM celler i en ex vivo rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive extracellulära matrisen och stroma ^6. Denna analys, hade dock begränsningen att förlita sig på en viss kommersiell mikroflödes slide, vars dimensioner och kostnader begränsat antal experiment eller läkemedel som skulle kunna utföras på en gång i en given del av utrustningen.

Det här beskrivna systemet förlänger denna ursprungliga analys i en hög-throughput organotypisk dos-respons plattform, för in vitro-screening av läkemedel, baserat på en digital bildanalys algoritm för att icke-destruktivt kvantifiera cellernas livskraft. Varje brunn i 384 eller 1536 brunnar är en 3D-rekonstruktion av benmärgsmikro, inklusive primär MM celler, extracellulär matris och patientgenererade stroma och tillväxtfaktorer. Levande mikroskopi och digital bildanalys används för att detektera celldödshändelser i olika läkemedelskoncentrationer, som används för att generera dos-responsytor. Från de data in vitro, en matematisk modell identifierar storleken och chemosensitivity av delpopulationer i patientens tumörbörda, och kan användas för att simulera hur tumören skulle svara på läkemedlet (er) i fysiologiska betingelser i en klinisk kur ⁶ ( Figur 1).

De viktigaste nyheterna i denna plattform är: (a) litet antal cancerceller som krävs (1,000-10,000 per läkemedel concentranson); (B) bedömning av läkemedlets effektivitet i fysiologiska förhållanden (extracellulärmatrix, glatta, patientgenererade tillväxtfaktorer); (C) Ingen toxicitet från livskraft markörer ⁷ eftersom endast ljusa fält avbildning används, alltså ingen anledning att transfektera celler med fluorescens ⁸ eller bioluminiscens ^9; (D) kontinuerlig avbildning ger läkemedelseffekt som en funktion av koncentration och exponeringstid (farmakodynamik); och (e) integrationen mellan in vitro och beräknings evolutionära modeller för att uppskatta kliniska resultat ⁶ (Silva et al., som en förberedelse).

Den viktigaste faktorn som gör att digital bildanalys algoritm för att urskilja cancer från stromala celler är deras olika affinitet till botten av brunnen: MM celler inte vidhäftar, och förblir i suspension i matrisen, medan stromaceller vidhäfta till botten av väl och sedan sträcka.

Denna separation inträffar trots MM och stroma enre ympades vid samma tid, och sker under O / N-processen för inkubation. Den snurrar i centrifugen efter sådd av plattan accelererar ytterligare denna process. Som en konsekvens, MM-celler visas i bilden som runda ljusa skivor omgivna av en mörk ring, medan stroma bibehåller en låg profil och en mörkare nyans (Figur 2). Således är bäst lämpad för icke-vidhäftande cancerceller analysen i sin nuvarande form, även om justeringar i algoritmen kan göras för att separera cancer och stroma utifrån andra morfologiska egenskaper, såsom storlek och form. I detta protokoll beskriver vi två typer av extracellulära matrix (kollagen och basalmembranet matris) samt två typer av co-kulturer, med (benmärgs härledd mesenkymala stamceller) BMSC och HUVEC, som företräder de mellanliggande och perivaskulära nischer i benmärgen , respektive.

Med hjälp av en 384-brunnar, 5 koncentrationer per läkemedel och två repliker, kunde vi test upp till 31 olika läkemedel med prov av en enda patient. I 1536-brunnsplattor detta antal är 127. Figur 3 visar layouten för närvarande används för manuell cellsådd, medan Supple Figur 1 representerar den optimala fördelningen med användning av en robotliknande pipett. Vid utformningen av figur 3, kan varje 384-brunnar bära 3 patientprover med 7 olika läkemedel, eller en patientprovet testas med 21 läkemedel. Varje läkemedel representeras av fem koncentrationer, och varje tillstånd såddes i dubbletter. 4 kontrollbrunnar (inget läkemedel tillsatt) sås för varje uppsättning av 7 läkemedel (t.ex., brunnar 36-39, 126-129 och 200-203). För att säkerställa potensen hos de läkemedel som används, är också ympade, och drogade i duplikat vid den högsta koncentrationen av var och en av de läkemedel som används (brunnar 76-89) en human myelomcellinje (t.ex. H929 eller MM1.S). Den positiva cellinje kontroll säkerställer att de läkemedel som används har tillräcklig styrka, eftersom deras dosresponskurvor är jämförbara across experiment. Två brunnar sås med en myelomcellinje som kontroll för de miljöförhållanden, med andra ord, för att upptäcka eventuella problem i bänk inkubator under avbildning (brunnar 75 och 90). Uppräkningen av brunnarna följer ett sicksackmönster, för att minska avståndet som täcks av den motoriserade steget av mikroskopet, vilket minskar anskaffningstiden och reducerar slitage på utrustningen.

Protocol

Användningen av mänskliga celler från biopsier som beskrivs nedan godkändes av Moffitt institutionella Review Board och genomförs inom ramen för den kliniska prövningen MCC # 14745 bedrivs vid H. Lee Moffitt Cancer Center och Forskningsinstitut. 1. Sortering av MM Celler från benmärgsaspirat Samla benmärgsaspirat (20 ml) från patienter i natriumheparin spruta. Isolera mononukleära celler genom att centrifugera utspädd märg (1: 1 med steril PBS) över ett st…

Representative Results

Flödet av experimentet beskrivs kortfattat i figur 1 Om alla åtgärder slutförts, bilderna som erhållits genom mikroskopet ska motsvara Figur 2:. Levande MM celler bör tydligt ses som ljusa diskar och BMSCs eller HUVECs bör vara knappt synlig och väl fördelad i bakgrunden. Såsom framgår av fig 2A, MM-celler varierar i storlek från en patient till en annan, men i allmänhet är de mindre än cellinjer. Eftersom de praktiskt taget inte replikera ex vivo</em…

Discussion

Sammanfattningsvis är detta en kraftfull och hög genomströmning metod för att kvantifiera chemosensitivity av primära MM celler och ex vivo farmakodynamik av läkemedel i en rekonstruktion av benmärgen. De kritiska steg inom detta protokoll är korrekt sådd av brunnarna och tillräcklig fokusering (se figur 2 för förväntade resultat): se till att MM och stromaceller är jämnt fördelade, att stromaceller är anhängare till botten av brunnen, att alla MM celler är i samma fokalplane…

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system