Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Appena isolate tumore-specifici cellule endoteliali (TEC) possono essere usati per esplorare i meccanismi molecolari di angiogenesi tumorale e servire come un modello in vitro per lo sviluppo di nuovi inibitori dell'angiogenesi per il cancro. Tuttavia, a lungo termine in espansione in vitro di cellule endoteliali murine (EC) è difficile a causa di deriva fenotipica nella cultura (passaggio endoteliale-a-mesenchimale) e la contaminazione con i non-CE. Ciò è particolarmente vero per TEC, che sono prontamente outcompeted da fibroblasti co-purificate o cellule tumorali in coltura. Qui, un metodo di isolamento ad alta fedeltà che sfrutta arricchimento immunomagnetica accoppiato con selezione delle colonie e in espansione in vitro è descritto. Questo approccio genera frazioni pure CE che sono completamente libero di contaminare cellule stromali o tumorali. E 'inoltre dimostrato che lignaggio tracciato Cdh5 cre: / l topi reporter ZsGreen l / s, utilizzati con il protocollo qui descritto, sono un valido strumento per verificare cellularepurezza isolate colonie CE di questi topi mostrano durevole e brillante fluorescenza ZsGreen nella cultura.
Introduction
Le cellule endoteliali (EC) sono essenziali durante lo sviluppo di tumori solidi. Da inizio dello switch angiogenico nei tumori dormienti per la diffusione e la semina delle metastasi a siti distanti, CE formano i condotti che forniscono sangue, ossigeno e sostanze nutritive per sostenere la crescita del tumore 1. Come recentemente suggerito, CE hanno anche funzioni di perfusione indipendente e formano una nicchia che supporta la crescita delle cellule staminali del cancro e di altre cellule stromali del tumore 2-5. Così, altamente purificato CE (TCE) per la cultura in vitro tumore-specifica permette di studi funzionali di routine che faranno luce sui meccanismi molecolari che mediano l'angiogenesi tumorale e diafonia con le cellule tumorali.
CE sono altamente specializzata a seconda del tessuto di origine 6. A causa della natura eterogenea dei diversi tipi di tumore e il microambiente tumorale, TEC può anche visualizzare le caratteristiche uniche che riflettono un tumore-specifica specializzazione of il sistema vascolare. Ad esempio, vi è la variabilità sorprendente nelle firme di espressione genica nel TEC isolate da diversi tipi o categorie di tumori 7,8. Tuttavia, frequenti co-purificazione di non CE, in particolare fibroblasti associati al tumore e le cellule tumorali, con TEC può confondere le analisi di espressione su scala genomica. Questi tipi di cellule indesiderate sono particolarmente problematico in studi che si basano su a lungo termine in espansione in vitro di culture TEC.
Descritto qui è un metodo ad alta fedeltà che produce costantemente le colture pure CE da tumori e di altri tessuti. A seguito di colonna immunomagnetica arricchimento delle frazioni e la rimozione di co-purificato non CE CE, un passo clonazione anello aggiuntivo per catturare colonie puri CE viene utilizzato 9. Ogni colonia può essere espansa in coltura per più passaggi, senza l'emergere di contaminazione non CE. Questo metodo produce anche più cloni CE da una singola procedura di isolamento, che è ideale per lo studio di endoeterogeneità thelial. Inoltre, è dimostrato che Cdh5 cre: / l topi ZsGreen l / s giornalista sono uno strumento prezioso per la generazione EC "destino-mapped" e indelebilmente marcato che mantengono ZsGreen fluorescenza nella cultura 10. Con piccole modifiche al protocollo, questo metodo dovrebbe essere adattabile a diversi tipi di tumore o tessuti normali.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa delle difficoltà di ottenere colture TEC primaria pure, molti studi in vitro TCE sostituto con le linee disponibili in commercio CE o primaria CE, come vena ombelicale umano CE (HUVEC) 13. Tuttavia, queste popolazioni CE dai tessuti normali possono servire solo come un proxy per TEC che si differenziano nettamente dalle loro controparti normali. Ad esempio, TEC sono fenotipicamente e funzionalmente anormale in vivo e alcune di queste anomalie può essere trasmissibile in vitro</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
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