종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
갓 절연 종양 특이 내피 세포 (TEC)는 종양 혈관 신생의 분자 메커니즘을 탐구 및 암에 대한 새로운 혈관 신생 억제제를 개발하기위한 시험 관내 모델로서 기능 할 수있다. 그러나 쥐의 내피 세포 (EC)의 체외 확장에 장기적으로 인해 비 EC와 표현형 문화 드리프트 (내피 – 투 – 중간 엽 전환) 및 오염에 도전한다. 이것은 쉽게 문화의 공동 정제 섬유 아 세포 또는 종양 세포에 의해 outcompeted된다 TEC 특히 사실이다. 여기서, 콜로니를 선택하여 시험 관내 확장에 결합 면역 자기 농축 활용 고음질 분리 방법이 설명된다. 이 접근법은 기질 또는 종양 세포를 오염 완전히 무료 EC 순수한 분획을 생성한다. 또한 그 혈통 추적 Cdh5의 CRE 주심 : 프로토콜 사용의 ZsGreen 리터 / S / L 기자 마우스는, 여기에 기술, 세포를 확인하는 유용한 도구입니다이 마우스에서 분리 된 EC의 식민지로 순도는 문화의 내구성과 화려한 ZsGreen이 형광을 보여줍니다.
Introduction
내피 세포 (EC)는 고형 종양의 개발 과정에서 필수적이다. 보급과 먼 부위에서 전이의 파종에 휴면 종양에서 혈관 신생 스위치의 시작에서, EC는 종양 성장 1을 유지하기 위해 혈액, 산소를 공급 도관과 영양분을 형성한다. 최근에 제안 된 바와 같이, EC는 관류 독립 펑션이 암 줄기 세포 및 다른 종양 간질 세포 2-5의 성장을 지원하는 틈새를 형성한다. 따라서, 높은 종양 특이 체외 문화에 대한 EC (TEC)는 종양 혈관 신생 및 종양 세포와 혼선을 매개하는 새로운 분자 메커니즘을 밝혀됩니다 루틴 기능 연구를 허용 정제.
EC는 기원 6의 조직에 따라 고도의 전문이다. 때문에 다른 종양 유형의 이질적인 성격과 종양 미세 환경에, TEC는 또한 종양 특이 전문화 O를 반영하는 고유의 기능이 표시 될 수 있습니다혈관 F. 예를 들어, 다른 유형의 종양 또는 7,8의 성적으로부터 격리 TEC에서 유전자 발현 서명에 현저한 변화가 존재한다. 그러나, TEC 비-EC, 특히 종양 관련 섬유 아 세포와 종양 세포의 빈번한 공동 정화는 게놈 전체의 발현 분석을 혼동 할 수 있습니다. 이러한 원치 않는 세포 유형은 TEC 배양 시험관 팽창 장기에 의존 연구에서 특히 문제가된다.
여기에 설명이 지속적으로 종양과 다른 조직에서 순수한 EC 문화를 생산하는 고품질의 방법이다. EC의 분수와 공동 정제 비 EC의 제거의 면역 자기 열 농축에 따라, 추가 복제 링 단계 9를 사용하는 순수한 EC 식민지를 촬영합니다. 각 콜로니 비 EC 오염의 발생없이 여러 통로 용 배양에서 확장 될 수있다. 이 방법은 엔도의 연구를위한 이상적인 단일 분리 과정에서 다중 EC 클론을 수득상피 이질성. ZsGreen이 리터 / S / L 기자 마우스 문화 10 ZsGreen이 형광을 유지 "운명 매핑"과 지워지지 표시된 EC를 생성하기위한 유용한 도구입니다 : 또한, Cdh5 CRE는 것을 알 수있다. 프로토콜에 약간의 조정으로,이 방법은 다른 유형의 종양 또는 정상 조직에 적용 할 수 있어야합니다.
Protocol
다음 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 실험 동물 의학의 부에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다. 1. 시작하기 전에 다음 재료 및 시약 준비 400 ml의 낮은 혈당 보충에 의해 EC 미디어를 준비 (1g / L의 D- 글루코스 또는 LG) 둘 베코의 수정 50 ml의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청, 5 ml의 항생제 항진균제 50 ㎖ 뉴 – 세럼 IV, 독수리의 매체 (DMEM) 상업 키트에서 hFGF의,…
Representative Results
EC는 대부분의 성인 조직 (11)의 전체 세포 인구의 작은 부분을 나타냅니다. 그것은 완전히 세포 외 기질 (ECM) 및 결합 조직에서 EC의 최대 방출을 보장 단일 세포 현탁액으로 수확 된 조직을 소화하는 것이 중요하다. 우리의 경험에 의하면, CD31 매개 면역 자기 선택은 풍부한하지만 순수한 EC의 분수를 제공하며, 따라서, 또 다른 중요한 단계는 클로닝 링 (도 1)를 사용하여 EC 콜로…
Discussion
때문에 순수 차 TEC의 문화, 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 13 상업적으로 이용 가능한 EC 라인 또는 기본 EC와 시험관 연구에서 많은 대체 TEC를 얻기에 어려움. 그러나, 정상 조직에서 이러한 EC의 인구는 정상적인 대응에서 크게 차이가 TEC에 대한 프록시 역할을 할 수있다. 예를 들어, TEC는 생체 내에서 표현형 및 기능적 이상이며, 이러한 이상 중 일부는 체외 14-18에서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
References
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Cite This Article
Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (104), e53072, doi:10.3791/53072 (2015).