Выделение и культура Расширение опухоли конкретных эндотелиальных клеток
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Свежевыделенные опухолевые специфические эндотелиальные клетки (TEC) может быть использован для изучения молекулярных механизмов ангиогенеза опухоли и служат модели в пробирке для разработки новых ингибиторов ангиогенеза рака. Тем не менее, долгосрочные в пробирке расширения мышиных эндотелиальных клеток (ЭК) является сложной задачей из-за дрейфа в фенотипической культуры (переход эндотелия к мезенхимальных) и загрязнения с не-ЕС. Это особенно верно для TEC, которые легко outcompeted посредством взаимодействующих очищают фибробластов или опухолевых клеток в культуре. Здесь метод изоляции с высокой точностью, что использует иммуномагнитной обогащения в сочетании с выбором колонии и в расширении пробирке описано. Этот подход порождает чистые фракции ЕС, которые полностью свободны от загрязнения стромальных клеток или опухолевых. Он также показал, что клонов-прослеживается Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с, используемые при работе с протоколом, описанным в данном документе, являются ценным инструментом, чтобы проверить ячейкучистота, как изолированных колоний ЕС из этих мышах показывают прочный и блестящий ZsGreen флуоресценции в культуре.
Introduction
Эндотелиальные клетки (ЭК) имеют важное значение при разработке твердых опухолей. Из инициации ангиогенного переключателя в неактивных опухолей к распространению и посева метастазов в отдаленных местах, ЕС образуют трубопроводы, которые обеспечивают крови, кислорода и питательных веществ для поддержания роста опухоли 1. Как недавно предложил, ЕС также перфузии-независимых функций и образуют нишу, которая поддерживает рост раковых стволовых клеток и других опухолевых клеток стромы 2-5. Таким образом, высокой степени очистки опухоли конкретных EC (TEC) для культуры в пробирке позволяет рутинных функциональных исследований, которые проливают свет на новые молекулярные механизмы посредников опухолевый ангиогенез и перекрестные помехи с опухолевыми клетками.
ЕС являются узкоспециализированными в зависимости от ткани происхождения 6. В связи с гетерогенной природы различных типов опухолей и микросреды опухоли, ТЭЦ может также отображать уникальные особенности, которые отражают опухоли конкретных специализации Oе сосудистой. Например, поражает изменчивость сигнатур экспрессии генов в TEC, выделенных из различных типов или классов опухолей 7,8. Тем не менее, часто совместно очистка не-ЕС, особенно опухолеассоциированных фибробластов и опухолевых клеток, с TEC может посрамить выражение генома анализов. Эти нежелательные типы клеток особенно проблематичным в исследованиях, которые полагаются на долгосрочной перспективе в пробирке расширения ТИК культур.
Описанный здесь метод высококачественный, которые последовательно производит чистые культуры ЕС от опухолей и других тканей. После обогащения иммуномагнитный столбца фракций ЕС и удаления совместно очищают не-ЕС, дополнительный шаг клонирования кольцо для захвата чистых колоний ЕС используется 9. Каждая колония может быть расширена в культуре для многих пассажей без возникновения загрязнения не входящих в ЕС. Этот метод также дает несколько клонов ЕС от одной процедуры изоляции, которая идеально подходит для изучения эндоthelial неоднородность. Кроме того, показано, что Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с ценным инструментом для создания "судьба-карту" и неизгладимо-маркировку СЕ которые поддерживают ZsGreen флуоресценции в культуре 10. С незначительными изменениями к протоколу, этот метод должен быть адаптированы к различным типам опухолевых или нормальных тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за трудностей в получении чистых первичных TEC культур, многие в пробирке исследования заменитель TEC с коммерчески доступных линий ЕС или первичной ЕС, таких как пупочной вены человека (HUVEC ЕС) 13. Тем не менее, эти группы населения ЕС от нормальных тканей может служить то…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).
- Dudley, A. C. Tumor endothelial cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).
- Aird, W. C. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
